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類器官培養(yǎng)系統(tǒng)--- HUMIMIC

類器官是指在結(jié)構(gòu)和功能上都類似來源器官或組織的模擬物，通過取特定器官的干細(xì)胞（iPS/ES），或者利用人的多能干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，能獲得微型的器官樣的三維培養(yǎng)物，在體外模擬人體器官發(fā)育過程。

類器官，具有某一器官多種功能性細(xì)胞和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的三維（3D）培養(yǎng)物，主要來源于人具有多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞（包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSCs）或成體干細(xì)胞。人多能干細(xì)胞能分化為個體所有類型的細(xì)胞，在體外，經(jīng)過誘導(dǎo)分化，模擬人體器官發(fā)育過程，能使人多能干細(xì)胞直接分化形成各種類器官；不同組織器官都存在內(nèi)源組織干細(xì)胞，在維持各器官的功能形態(tài)發(fā)揮著重要作用。這些干細(xì)胞在體外一定的誘導(dǎo)條件下，可以自組織形成一個直徑僅為幾毫米的具有組織結(jié)構(gòu)和多種功能細(xì)胞的三維培養(yǎng)物。器官芯片是獲取兩個或兩個以上不同的類器官，并且放置在特定的培養(yǎng)芯片上進(jìn)行共培養(yǎng)，能模擬人體的多個器官參與的生理學(xué)過程。

與傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)模式相比，3D培養(yǎng)的類器官包含多種細(xì)胞類型，能夠形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模擬器官組織的發(fā)生過程及生理病理狀態(tài)，因而在基礎(chǔ)研究以及臨床診療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

基于這一定義，可以發(fā)現(xiàn)類器官具備這樣幾個特征：

? 必須包含一種以上與來源器官相同的細(xì)胞類型；

? 應(yīng)該表現(xiàn)出來源器官所特有的一些功能；

? 細(xì)胞的組織方式應(yīng)當(dāng)與來源器官相似。

類器官作為一個新興的技術(shù)，在科學(xué)研究領(lǐng)域潛力巨大，包括發(fā)育生物學(xué)、疾病病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、再生機(jī)制、精 準(zhǔn)醫(yī)療以及藥物毒性和藥效試驗(yàn)。類器官培養(yǎng)使研究人體發(fā)育提供了不受倫理限制的平臺，為藥物篩選提供了新的平臺，也是對現(xiàn)有2D培養(yǎng)方法和動物模型系統(tǒng)的高信息量的互補(bǔ) 。此外，類器官為獲取更接近自然人體發(fā)育細(xì)胞用于細(xì)胞治療成為可能。通過類器官繁殖的干細(xì)胞群取代受損或者患病的組織，類器官提供自體和同種異體細(xì)胞療法的可行性，未來這一技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也擁有巨大的潛力 。使用這項(xiàng)技術(shù)，采用CRISPR/Cas9能夠糾正體外遺傳異常并能夠?qū)⒔】档霓D(zhuǎn)基因細(xì)胞再次回輸入患者體內(nèi)，并在后期整合入組織內(nèi)。在精 準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，患者衍生的類器官也被證明為有價值的診斷工具。在進(jìn)行治療之前，采用從患者樣本來源的類器官篩查患者體外藥物反應(yīng)，旨在為癌癥和囊胞性纖維癥患者的護(hù)理提供指導(dǎo)并預(yù)測治療結(jié)果。隨著類器官培養(yǎng)系統(tǒng)以及其實(shí)驗(yàn)開發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展，類器官應(yīng)用到了各大研究領(lǐng)域。

類器官可以模擬人體的內(nèi)外環(huán)境和人體器官，幫助研究人員觀測用藥會對人體器官功能產(chǎn)生什么樣的影響。在提倡精 準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個體化治療的時代，類器官研究比傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)更具有針對性，并且可以區(qū)別不同癌癥對于相同藥物的反應(yīng)。不僅如此，研究者還希望通過誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞強(qiáng)大的再生潛能，體外生成新的器官或組織，然后移植入體內(nèi)以替代損壞的組織器官。

類器官培養(yǎng)系統(tǒng)--- HUMIMIC的應(yīng)用案例

腸類器官：HansClever 課題組證實(shí)單一的Lgr5 +干細(xì)胞能夠在體外持續(xù)增殖并自組裝形成隱窩－絨毛樣的小腸上皮結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，單個成人Lgr5 + 干細(xì)胞也能在體外成功擴(kuò)增成結(jié)腸類器官，將這種功能性的結(jié)腸上皮移植到硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型中可以修復(fù)其受損的結(jié)腸上皮。這提示利用單一成人結(jié)腸干細(xì)胞體外擴(kuò)增進(jìn)行結(jié)腸干細(xì)胞治療是可行的。有學(xué)者還應(yīng)用人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞( induced pluripotent stem cells，iPSCs) 直接定向分化為小腸組織的方法明確了Wnt3a 蛋白和成纖維細(xì)胞生長因子4 是后腸特定分化所必需的物質(zhì)，而且，這種iPSCs體外構(gòu)建的人體腸道組織中存在的小腸干細(xì)胞，也具有小腸特有的吸收和分泌功能。這有助于未來人腸道疾病藥物的設(shè)計(jì)研究，可大大提高了藥物利用率。目前，已有學(xué)者構(gòu)建了小鼠小腸3D 類器官來進(jìn)行P-糖蛋白抑制劑的篩選，為P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了強(qiáng)有力的工具。

肝類器官：2013 年，Takebe 等將人多能干細(xì)胞來源的肝細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞混合后在基質(zhì)膠中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3 種細(xì)胞自組裝成3D 化肝芽，將該肝芽移植到丙氧鳥苷誘導(dǎo)肝臟衰亡的TKNOG 小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn)這種肝芽可以連接小鼠腸系膜血管，小鼠也出現(xiàn)了人類特有的藥物代謝過程。這為肝臟器官發(fā)生的研究提供了有益嘗試。大型哺乳動物的類器官再造工程也許能加速人類器官移植治療和疾病致病機(jī)制研究的進(jìn)展。2015 年，Nantasanti 等利用狗的肝臟干細(xì)胞構(gòu)建了可分化為功能性肝細(xì)胞的肝類器官模型，能用于銅潴留癥的治療。貓被認(rèn)為是非常適用于研究人類代謝性疾病的模型，所以利用貓的膽道組織構(gòu)建肝類器官，可能是原發(fā)性肝膽疾病研究及藥物篩選的有益工具，但至今也未見利用貓建立長期保持基因穩(wěn)定的肝臟干/祖細(xì)胞培養(yǎng)體系的報道。

胰腺類器官：有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制骨形態(tài)發(fā)生蛋白堿性成纖維細(xì)胞生長因子、激活素A 和Wnt3a 的表達(dá)水平或使用一些小分子化合物進(jìn)行干預(yù)時，可以控制內(nèi)胚層細(xì)胞向特定的方向分化，* 終形成胰腺。目前，構(gòu)建胰島類器官的主要方法包括利用各種干祖細(xì)胞產(chǎn)生胰島樣細(xì)胞群和利用各種來源的胰腺細(xì)胞懸液或胰腺組織塊自組裝成擬胰島體。2011 年，Saito 等將人iPSCs 和胚胎小鼠胰島細(xì)胞體外共培養(yǎng)，* 后形成能夠產(chǎn)生胰島素的不成熟細(xì)胞群，該細(xì)胞群由胰島α 細(xì)胞包繞中央的β 細(xì)胞構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)和成年鼠胰島相似，將其移植到鏈脲菌素誘導(dǎo)的高血糖小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)小鼠血糖水平得到極大改善。而進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究還需要關(guān)注如何規(guī)避免疫反應(yīng)、促進(jìn)再血管化、促進(jìn)類器官分化發(fā)育等問題，在這方面，Sabek 等提出制備納米腺體來促進(jìn)胰島發(fā)揮作用，這種納米腺體是運(yùn)用3D 打印技術(shù)制作可吸收聚合物膠囊包裹胰島樣細(xì)胞團(tuán)形成的，這可能是未來胰島類器官應(yīng)用的一種思路。

腦類器官：近來，譜系重編程技術(shù)為獲取特異性種子細(xì)胞提供了新的途徑。Lancaster 等通過加入不同生長因子的方法將人類胚胎干細(xì)胞( embryonic stem cell，ESC) 和iPSC 在神經(jīng)培養(yǎng)基3D 培養(yǎng)出了與9 ～ 10周胚胎大腦類似的“類大腦”，此類迷你大腦具備人類大腦發(fā)育初期的一些主要區(qū)域，也出現(xiàn)了背側(cè)皮層、腹側(cè)前腦等可辨認(rèn)的特征，但由于缺乏一些特定的特征，如小腦、海馬狀突起等，這些區(qū)域無法應(yīng)用于干細(xì)胞模型。之后，該研究者利用小顱畸形患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)形成了患者特異性iPSC 細(xì)胞系，并應(yīng)用后者構(gòu)建了小顱畸形腦類器官模型，通過對照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常ESC和該iPSCs 在類器官形成上并沒有明顯差異，但是后者形成的類器官中有大量未成熟的神經(jīng)元分化，這為大腦發(fā)育紊亂類疾病的研究提供了一定的思路。2015年Kirwan 等應(yīng)用人iPSC 體外構(gòu)建了人大腦皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能夠模擬人體內(nèi)皮層網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育和功能，這表明可以在體外通過構(gòu)建大腦類器官來進(jìn)行人類前腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)生理學(xué)機(jī)制的研究。

前列腺類器官：2014 年，研究人員**在實(shí)驗(yàn)室利用來自轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的活檢標(biāo)本和去勢抵抗性前列腺癌( castration-resistant prostate cancer，CＲPC) 患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞成功培育出7 個前列腺癌類器官，這些前列腺癌類器官以及從中獲得的腫瘤移植物的組織結(jié)構(gòu)及基因突變譜與患者轉(zhuǎn)移灶樣本高度相似。Nicholson 等［21］也應(yīng)用類器官培養(yǎng)技術(shù)成功在體外構(gòu)建患者來源的異種移植物模型，相比于人源性腫瘤組織異種移植及基因工程鼠模型，這種新型的患者來源的類器官能更好地代表CＲPC 等高級別前列腺癌，還能代表前列腺癌的龐大臨床疾病譜，而這種疾病譜是目前僅有的前列腺癌細(xì)胞系無法代表的，因而在前列腺癌藥物篩選和個體化治療中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

類器官培養(yǎng)系統(tǒng)--- HUMIMIC的技術(shù)方案：在沒有病人的情況下測試病人

為獲取更高相關(guān)與準(zhǔn)確的測試結(jié)果，我們開發(fā)了人體器官模型的自動芯片測試：

配備具有指示相關(guān)性的器官模型的芯片，以能夠在接觸生物體之前檢測其安全性和有效性

*終為芯片配備患者自身相關(guān)病變器官的亞基，以評估整個個性化治療的效果

技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：專業(yè)化的硬件、專業(yè)化的軟件、特定細(xì)胞、芯片系統(tǒng)、技術(shù)服務(wù)

一、技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：專業(yè)化的硬件

專門設(shè)計(jì)用于在芯片上進(jìn)行多重類器官培養(yǎng)的系統(tǒng)。該系統(tǒng)能夠模擬人體內(nèi)生理環(huán)境，包括溫度，濕度，氣流，壓力，液體流動等等，芯片底部有不通的微流道設(shè)計(jì)，針對不同的器官，可以單獨(dú)設(shè)置提供相應(yīng)的培養(yǎng)條件，提供精 準(zhǔn)的培養(yǎng)和分化環(huán)境。能高效均一的獲得用于研究或藥物篩選的類器官，具有較好的重復(fù)性。自動化細(xì)胞培養(yǎng)、分化一體設(shè)備可以高效提高類器官定向分化成功率。包括：自動培養(yǎng)模塊；自動換液模塊（可以執(zhí)行至少多種不同的培養(yǎng)基/溶液的換液操作）。該系統(tǒng)能同時培養(yǎng)4種不同的類器官，通過微流控聯(lián)在一起，進(jìn)行多器官串聯(lián)培養(yǎng)研究。

二、技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：專業(yè)化的軟件

TissUse Control Unit 自帶液晶觸摸控制屏，無需外接電腦，軟件操控非常友好，可以自主設(shè)置每個器官芯片的培養(yǎng)條件，包括溫度，壓力，真空百分比，時間等參數(shù)，來達(dá)到器官培養(yǎng)的* 佳條件。此外，TissUse Control Unit不需要除了器官芯片之外的耗材，也不需要頻繁繁瑣的維護(hù)，半年進(jìn)行一個維護(hù)校準(zhǔn)即可，使用維護(hù)成本較低。

三、技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：特定細(xì)胞

四、技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：芯片系統(tǒng)

五、技術(shù)方案的配套系統(tǒng)：技術(shù)服務(wù)

參考文獻(xiàn)