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細胞系在某些培養條件下可能形成弱聚集的團聚體和更難分離的聚集體，譬如人胚胎腎細胞（HEK）（1）。通過軟件算法準確統計團聚體和聚集體中的細胞數會有困難，可能會導致細胞計數不準確。為了減輕這種情況，在取樣進行分析之前，可能需要優化樣品制備方法，以消除或減少較大的團聚體和聚集體（2）。Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀集成了軟件功能，可以更準確地對細胞團塊進行計數，在我們上一篇“團聚細胞計數的應用解決方案：Cell Type參數優化”應用短文中有更詳細的描述。

如果軟件不能有效識別和統計團聚體和聚集體中的細胞數量，Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀軟件將統計這些較大的細胞簇，并在圖像中用紅色方塊標記它們（下圖3）。由于軟件對大型（有時是三維）細胞簇的細胞計數不準確，所以其中的細胞沒有統計。但是，軟件會統計并報告這些較大的細胞簇數量。通過查看細胞簇的數量，您可以檢查特定樣本的聚集程度。由于大聚集體可能對懸浮細胞培養產生負面影響，原因包括代謝擴散減少導致細胞生長不良，以及質粒和病毒顆粒無法到達內部細胞，引起轉染和轉導效率下降從而導致滴度降低（3），因此這種情況最好停止培養。如果檢測確定細胞簇不可接受，但仍需要計數，則可能需要建立新的樣品制備過程。

對于在某些條件下難以分離聚集體的細胞系，如一些HEK293細胞培養，需要額外的團聚分離優化策略，即得到分離良好的細胞懸液由Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀檢測，從而實現更準確的細胞計數。在本應用短文中，我們描述了不同的分離介質和移液吹打對貼壁HEK293細胞的聚集程度、存活率和活細胞計數的影響。我們還提供了一種側樣制備技術，可以在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上獲得更準確的計數結果，而無需改變傳代培養細胞的現有分離方法。

在第一個實驗中，測試了3種酶分離介質：胰蛋白酶、含EDTA的胰蛋白酶和TrypLE。此外，用1000μL移液槍上下吹打，在單個樣品上測試每種分離介質。在第二個實驗中，在初始胰蛋白酶處理后采集側樣本，并用TrypLE處理。

分離介質優化過程

1、HEK293細胞在T75細胞培養瓶中生長，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%。

• 分別準備兩個培養瓶，用于測試胰蛋白酶、TrypLE和胰蛋白酶-EDTA作為分離處理

2、移除培養基，用5mL新鮮的無Ca2+、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細胞。

3、加入2mL分離介質，輕輕搖動培養瓶以確保單層細胞完全被覆蓋。培養細胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘。

注意：輕輕搖晃細胞上的培養基可以確保單層細胞完全被分離分離介質覆蓋，但是，敲擊或搖晃培養瓶太劇烈可能會導致大簇細胞立即被移除。

4、孵育2分鐘后，細胞完全從培養瓶中分離出來，加入10毫升含有10%FBS的溫熱DMEM，用10mL移液槍上下吹打5次，輕輕混合。

5、接下來將3mL培養細胞轉移到四個5mL試管中，將12mL培養細胞分開。

•  兩個試管被指定為未吹打對照，兩個被指定為吹打后的樣品。

-對于吹打好的樣品，用1000μL移液槍上下吹打1000μL懸浮液10次。

6、將試管輕輕翻轉3次進行混勻，將5個200μL的重復樣本分配到Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀樣品管中，并在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上測試結果。

• 通過在樣品管和重復樣本之間交替分析吹打后樣品和未吹打對照品的結果。譬如，吹打管1-重復1，未吹打管1-重復1，吹打管2-重復1，未吹打管2-重復1。

7、通過使用Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上默認設置和Mammalian細胞類型分析樣品。

8、對于每種分離介質，兩個培養瓶中的樣品檢測重復該流程。

表1. 試劑清單

分離介質優化結果

與胰蛋白酶處理的樣品相比，胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品的平均細胞簇數量顯著降低（p<0.05；Student's t-檢驗），表明使用胰蛋白酶-EDTA和TrypLE進行了更有效的細胞分離。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品細胞簇數量相似，表明兩種分離介質的性能相似。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品，吹打能夠顯著降低細胞簇數量（p<0.05；Student’s t-檢驗），表明通過移液槍吹打得到更弱的細胞簇，然而，吹打不能分離胰蛋白酶處理樣品中的聚集體。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE的活細胞密度相似，組間無顯著統計學差異（p>0.05；Student's t-檢驗）。在所有情況下，移液槍吹打都提高了存活率，這可能是由于在沒有團聚體和聚集體的情況下采用了更有效的計數算法。

圖1: 三種分離介質和吹打得到的平均細胞簇數量，平均活細胞密度和平均活率結果。結果是每組所有試管和培養瓶的所有重復的平均值。使用JMP 16.1.0版對數據進行分析。

側樣品分離方法

1、HEK293細胞在T75細胞培養瓶中生長，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%。

• 準備3個培養瓶來測試側樣品分離方法。

2、移除培養基，用5mL新鮮的無Ca2+、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細胞。

3、然后，加入2mL胰酶介質，輕輕搖動培養瓶以確保單層細胞完全被覆蓋。培養細胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘。

4、孵育2分鐘后，加入10 mL含有10%FBS溫熱的DMEM，用10mL移液槍上下吹打5次，輕輕混合。

5、接下來將3mL培養細胞轉移到四個5mL試管中，將12mL培養細胞分開。

• 兩個試管被指定為對照，另外兩個被指定為側樣品。

• 將兩個對照管翻轉3次，從每個管中取出3個200μL的樣品，并在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上測試結果。它們被指定為未經處理的對照組，代表了現有的傳代流程。剩余體積被指定為處理后的對照。

• 將兩個側樣品管翻轉3次，然后將所有4個管（兩個2400μL對照管和兩個3000μL側樣品管）在500 rcf下離心3分鐘使細胞沉淀。

6、離心后取出培養基，將細胞重新懸浮在400μL含10%FBS的DMEM（用于2個處理過的對照管）或500μL TrypLE（用于2側樣品管）中，然后用1000μL移液槍上下吹打10次以重新懸浮細胞。

7、在室溫下孵育2分鐘后，將樣品重新懸浮至初始體積（處理過的對照為2400μL，側面樣品為3000μL）。

8、用1000μL移液槍上下吹打樣品10次混合，然后將試管翻轉3次。

9、接下來，從每根試管中取五個200μL的重復樣本，在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上測試，在處理過的對照試管和側樣本試管之間以及重復樣本之間交替測試，每種情況共測試10次。例如，處理過的對照管1-重復1，側樣品管1-重復1，處理過的對照管2-重復1，側樣品管2-重復1。

10、使用默認設置和Mammalian細胞類型分析所有樣本。對總共3個培養瓶重復該流程。

側樣品分析結果

TrypLE處理的側樣本的細胞簇數量明顯低于未處理和處理的對照組（p<0.05；Student's t-檢驗）。經過額外處理步驟的胰蛋白酶處理的對照組和經TrypLE處理的樣本，VCD明顯高于未經處理的對照組（p<0.05；Student’s t-檢驗）。處理過的對照組較高的VCD可能是由于額外的混合和移液步驟導致團聚體分離開。額外的處理顯著降低了處理后對照組相比未處理對照組的存活率，略微降低了1.5%（p<0.05；Student's t-檢驗）。與未處理和處理的對照組相比，TrypLE處理顯著提高了存活率（p<0.05；Student's t-檢驗），這可能是因為在沒有團聚體的情況下計數更準確。

圖2: TrypLE處理后側樣品，未處理對照和介質處理后的對照。它們的平均細胞簇數量，平均活細胞密度和平均活率結果。結果是每組所有試管和培養瓶的所有重復的平均值。使用JMP 16.1.0版對數據進行分析。

對圖像的回顧顯示了胰蛋白酶處理樣本存在大的紅色框標記和一些較小的細胞團聚體（圖3左圖）。TrypLE處理的側樣本（圖3右圖）顯示了很少的細胞簇和較少的細胞團聚體。

圖3: 胰酶對照組（左）和TrypLE處理后的側樣品（右）的圖像示例

討論

如前所述，分離方法的選擇會顯著影響存活率、活細胞計數和聚集程度。通過移液槍進行溫和地吹打可能會分離弱聚集的團聚體，并且允許在不降低細胞活率的情況下進行更準確的計數。對于更大、更難分離且對移液槍吹打反應不佳的細胞簇，用替代的分離介質，譬如胰蛋白酶加EDTA或TrypLE，可以使細胞懸浮液更加分離。

最后，若繼續使用現有的分離方法，也可以選擇使用側樣技術，從而在Vi-CELL BLU細胞計數和活率分析儀上實現更準確的計數。

 ● 參考文獻： 

1. Iuchi et al. Cytotechnology Feb 2020; 72(1): 131-140. Different morphologies of human embryonic kidney 293T cells in various types of culture dishes

2. ISO 20391-1:2018 Biotechnology – Cell Counting – Part 1: General guidance on cell counting methods

3. Tsap. Y et al. Biotechnology Progress 2000; 16(5): 809-814. Biomass and Aggregation Analysis of Human Embryonic Kidney 293 Suspension Cell Cultures by Particle Size Measurement

4. Drummen, N. Cell Type settings considerations for counting clumpy cells on the Vi-CELL BLU cell viability analyzer. Beckman Coulter application note. Content ID: 2023-GBL-EN-101699