亚洲va中文字幕欧美不卡-亚洲va在线va天堂成人-亚洲va在线va天堂va手机-亚洲va在线va天堂va888www-国产精品扒开腿做爽爽爽王者A片-国产精品白浆一区二小说

無論是在學術研究領域還是在生物制藥工業中，選擇合適的啟動子實現高效的蛋白生產，在菌種和工藝開發中都起著至關重要的作用。研究表明甲基營養酵母多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha 或 Ogataea polymorpha）和畢赤酵母（Pichia pastoris）是異源基因表達的有效宿主微生物，可大規模生產各種重組蛋白。它們之所以具有吸引力，還因為它們使用甲醇作為唯一的碳源，需要一套獨特的代謝酶，其生產受到嚴格控制 。[1] 由于其獨特的特性，漢遜酵母廣泛用作重組蛋白生產的表達宿主：首先，相比有些哺乳動物的蛋白需要在37°C保持其生物活性，漢遜酵母菌具有耐熱性，有利于哺乳動物蛋白的生產。其次，蛋白質糖基化途徑的存在，使真核重組蛋白生產成為可能，同時可以避免過度糖基化。第三，其利用甲醇作為碳源的能力允許分離出強甲醇誘導型啟動子。此外，多形漢遜酵母菌還可利用諸如甘油、葡萄糖、木糖、纖維二糖等其他碳源。[2]

多形漢遜酵母菌能在甲醇培養基中產生大量醇氧化酶和甲醇代謝所需的其他酶。因此，形成酶的液泡充滿了細胞的大部分胞內空間。研究人員利用這種獨特的性質，通過將目的基因連接至醇氧化酶基因實現外源蛋白表達。[3] 將外源基因連接至醇氧化酶基因的啟動子，可獲得高水平重組蛋白。[1] 形漢遜酵母菌在理想培養條件下，使用甲酸脫氫酶（FMD）或甲醇氧化酶（MOX）等強啟動子可獲得超高蛋白滴度。甲基營養酵母的強分泌能力與成熟的高細胞密度發酵技術相結合，可使外源蛋白分泌量高達每升數克。[4] 這兩種啟動子均被葡萄糖或乙醇強烈抑制，而被甲醇作為唯一碳源高度誘導。如果甘油或葡萄糖的補料低于細胞生長限制速率，則MOX啟動子不受抑制。[1]

在本應用中，我們使用微型生物反應器BioLector探索漢遜酵母獲得高產量的綠色熒光蛋白（GFP）所需的PH條件。在本高通量發酵研究中，我們研究含有 FMD 和 MOX 啟動子的多形漢遜酵母菌種，以確定高效蛋白生產所需的首選 pH 范圍。截至目前，研究表明在小規模培養系統中低 pH 范圍 4-6 非常難以測定和控制。這里，光學 pH 傳感器是首選的測量系統。使用普通的傳感器往往只能在生理 pH 范圍內提供可靠的結果。在本研究中，我們將近期發布的低pH傳感器集成至 BioLector中，以便進行可靠的非侵入式pH 篩選，實現發酵過程 pH 控制，提高蛋白生產效率。pH通過微孔板（MTP）中的微流控芯片控制，并在紅外光譜范圍進行光學測量，以減少培養基中背景熒光的干擾。這使得BioLector高通量微型發酵平臺可在低 pH 條件下使用熒光報告基因（如 GFP）跟蹤整個發酵過程的蛋白表達。

方法

菌株

多形漢遜酵母RB11 MOX-GFP 菌株和 RB11 FMD-GFP 菌株

培養基

葡萄糖為碳源的無氨基酸酵母氮源培養基中（YNB-D）培養：含有1.34g/L 酵母氮源、5g/L (NH4)2SO4和20g/L葡萄糖。此外，使用不同濃度（100mM、50mM 和 25mM）的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）

培養條件

在BioLector中采用微流控梅花板進行培養。振搖速度1200rpm，溫度為 30°C。每孔培養體積 800μL。以 3M NaOH和3M HCl作為pH調節劑，通過微流控芯片在pH 4 –6范圍內雙向調節pH。

在線測量參數

生物量、GFP、pH和溶氧

結果

在不同緩沖液濃度的YNB-G培養基中進行分批培養：通過預篩選實驗研究GFP對培養基中磷酸鹽緩沖液濃度和未調節pH值的依賴趨勢。為此，在YNB-D中將漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP 菌株進行分批培養，磷酸鹽緩沖液濃度調節為25mM、50mM 或 100mM。GFP產量、pH值與培養時間的關系如圖1所示。只要培養基中含有葡萄糖，FMD啟動子就會受到抑制，因此當葡萄糖含量低或被完全消耗時，就會誘導GFP表達。正如預期，培養基緩沖液濃度越低，pH值下降越快。相比，低緩沖液濃度培養基中GFP產生的時間比高緩沖液濃度培養基更早。一個原因可能是低緩沖液濃度培養基滲透壓更低，培養條件更好，從而獲得更高的GFP產量。另一個原因可能是因為低緩沖液濃度培養基的pH值下降更快，而這種低pH的環境在代謝生產力方面是更好的。

進行pH分析以尋求GFP高效表達的最佳條件：在接下來的多形漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP菌株分批培養實驗中，使用緩沖液濃度為25mM的培養基，并在培養過程中通過BioLector的微流控芯片技術調控pH值。我們分析了pH在4.0- 6.5范圍的GFP 表達性能。圖 2顯示三組培養實例中GFP合成和pH控制情況。從初步分批培養實驗中可以看出，pH設定值越低，GFP開始表達的時間就越早。此外，pH設定值越低，GFP信號的斜率越陡。請注意，在這里GFP只是目的蛋白質的替代物，由于GFP在較低pH范圍內不穩定[5]，GFP在pH為4時的降解速度比在較高pH值時要快得多，因此這里只能作定性比較。

仔細觀察最大GFP信號（圖 3）以及隨后計算GFP表達的時空產率（圖 4），每一項根據調整的PH設定值繪制，證實了GFP在較低PH條件下表達較高的假設。盡管PH值為6時獲得最強GFP 信號（359.35 a.u.），但GFP表達的時空產率（STY）仍呈現隨PH增大而降低的趨勢。pH為4.0時獲得最高STY 10.24 I/mL*h。請注意，GFP 只是目的蛋白質的替代物，由于GFP在較低PH范圍內不穩定[5]，GFP 在PH為4時的降解速度比在較高PH值時要快得多。

評估不同啟動子：對多形漢遜酵母RB11 FMD-GFP菌株和RB11 MOX-GFP菌的培養數據進行比較，評估pH設定值固定為4.5的情況下GFP表達所用FMD和MOX 啟動子的特性。圖5為兩種株菌生物量和DO信號以及pH、GFP值與培養時間關系的曲線圖。從生物量和DO曲線上可看出，兩種菌株具有相似的生長行為。但是，GFP信號可以發現，多形漢遜酵母菌RB11 FMD-GFP菌株的GFP信號高出7倍。

結論

采用BioLector進行生物量、GFP、pH 和 DO 的非侵入式在線測量，可成功篩選出多形漢遜酵母蛋白表達的 pH 和菌株。本研究發現，較低pH 值和FMD 啟動子有利于 GFP 的表達（GFP 代表目標蛋白質）。此外，基于BioLector的微流控技術，可在一塊微孔板上同時進行多達32個不同條件的平行發酵以篩選漢遜酵母生產重組蛋白的最佳培養條件。

參考文獻[1] Raschke, W., Neiditch, B., et al. (1996) Inducible expression of a heterologous protein in Hansenula polymorpha using the alcohol oxidase 1 promoter of Pichia pastoris. Elsevier Science Gene 177, 163-167. [2] Manfr?o-Netto, J., Gomes, A. and Parachin, N. (2019) Advances in Using Hansenula polymorpha as Chassis for Recombinant Protein Production. Front. Bioeng. Biotechnol. 7:94. doi: 10.3389/fbioe.2019.00094 [3] Kurtzman, C. & Robnett, C. (2010) Systematics of methanol assimilating yeasts and neighboring taxa from multigene sequence analysis and the proposal of Peterozyma gen.nov., a new membe rof the Saccharomycetales. FEMS Yeast Res 10, 353–361. [4] Hartner, F. & Glieder, A. (2006) Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories, 5:39. doi:10.1186/1475-2859-5-3 [5] Campbell, T. & Choy, F. (2001) The Effect of pH on Green Fluorescent Protein: A Brief Review, Molecular Biology Today 2 (1), 1-4.