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摘要

小球藻因其高蛋白質含量和與世界衛生組織（WHO）推薦的人類營養素相似的氨基酸譜，以及富含人體必需營養素，廣泛應用于食品和飼料工業領域1。此外，小球藻在不利的生長條件下可積累C16和C18脂肪酸2,3，為污水處理廠生產生物燃料提供了可能1。

我們將為您展示搭載LAM的BioLector XT高通量微型生物反應器，適用于小球藻的光自養培養。此外，專門設計并驗證的濾光片模塊支持多種關鍵培養參數的在線監測。

概述

通常，小球藻是通過搖瓶在有限的實驗通量下進行培養。培養條件優化、藻株篩選和藻株工程是商業化的三大關鍵步驟4，例如，通過縮短葉綠素天線尺寸以最大限度地提高太陽能-產物能量轉換效率5。基于微孔的培養設備為微生物和哺乳動物細胞早期快速篩選提供了一種強大的工具6，并已成功應用于異養微藻生物工藝開發7。

微型光照生物反應器（μPBR）系統，可用于研究自養或混合營養培養條件，但目前的概念離系列技術還很遠，進一步的改進——尤其是可調節照明——是必要的8,9。

搭載精密光照模塊的BioLector XT高通量微型生物反應器，可在多達48個微孔中同時進行光營養培養。通過專門設計的濾光片模塊，可實現非侵入式、實時在線監測關鍵培養參數如生物量、葉綠素濃度和pH值。光照模塊（LAM）在光合光譜范圍內提供精確、多樣化的光照方案。其光譜的靈活性是通過16種不同的LED實現的，每一個LED都可以單獨控制，可提供近4000 μmol/m2/s的最大輻射。

方法

濾光片模塊開發

經專門設計并測試的濾光片模塊，可用于在線監測多種重要的光營養培養參數（生物量、葉綠素含量和pH值）。

小球藻

無菌小球藻（SAG藻株編號211-11b）由哥廷根大學藻種保藏中心提供。

培養基

在pH值為6.5的改良Bold基礎培養基（enBBM）中進行培養10-13。

在搖瓶中預培養

將小球藻置入振幅為50mm的搖瓶中，在25℃培養箱中以180rpm振速進行預培養。為實現光營養生長，在培養室的一側安裝LED模塊，同時在搖瓶口使用棉塞，方便氣體出入培養液。LED模塊由8個平行安裝的模擬太陽光LED燈條組成（LUMITRONIX LED-Technik GmbH）。將輻照度設置為200μmol/m2/s，使之與BioLector XT微型生物反應器培養時的輻照度一致。

在BioLector XT微型生物反應器中培養

采用Flowerplate梅花板[M2P-MTP-48-B]進行光營養培養，初始細胞密度為5.5*106個細胞/mL，培養體積為1mL。用透氣性密封膜（MTP-F-GPRS-48-10）密封微孔板，方便光合作用期間二氧化碳和氧氣的交換。照明模塊設置為提供400~700nm的類太陽光譜，光子通量密度約為200 μmol/m2/s（圖1）。

圖1. 培養期間的照明光譜和輻照度

將培養參數設置為800 rpm、25℃和85% 的相對濕度，并按10 mL/min流速充入空氣和 2% 的CO2混合物。

結果

濾光片模塊校準

圖2.濾光片模塊校準結果圖組

生物量

經專門開發的730、750和850 nm生物量濾光片模塊，可在0.3≦OD750≦25范圍內顯示出卓越的校準效果，730 nm模塊校準結果如圖2.A所示。此外，使用葉綠素a和葉綠素b標準品，未發現葉綠素干擾。

葉綠素含量

葉綠素校準結果顯示，經專門設計的濾光片模塊可單獨或同時檢測葉綠素a和葉綠素b，如圖2.B所示。

葉綠素熒光常用于測定光營養培養物的生物量14,15。因此，使用生物量系列稀釋液進行校準，應用指數遞減擬合時，在低生物量濃度下可觀察到極佳的分辨率如圖2.C所示。校準結果證實，葉綠素熒光濾光片器可準確測定生物量濃度，特別是在生物量濃度較低的時候。

pH值

分別在25、30、35和40℃下，使用含0.1 mg/L HPTS的pH 5~10緩沖溶液（Merck, Darmstadt, DE）對pH濾光片模塊進行校準。校準結果出色（圖2.D），證明所該設置適用于在線準確測定pH值。

為確保擬定方法對光漂白不敏感，我們在BioLector XT微型生物反應器中使用無接種物enBBM在200μmol/m2/s典型培養條件進行培養實驗（圖2.E）。實驗開始后，CO2濃度的增加使培養基迅速酸化（~0.05pH），但在之后的130小時內，測量值（圖2.E）始終保持恒定。這一點證明，在連續光照的培養條件下，使用HPTS測定pH，可連續多日保持準確、穩定的測量水平。

在BioLector XT微型生物反應器中并行光營養培養

經過對濾光片模塊進行驗證之后，我們開始長期培養，并使用四個濾光片模塊進行在線監測：730nm的散射光模塊，葉綠素熒光濾光片模塊（λex=450nm；λem=700nm）和兩種HPTS濾光片模塊進行比值pH測定(圖3)

圖3. 搭載光照模塊的BioLector XT微型生物反應器，為期16天的培養中所監測的散射光、葉綠素和pH值

如圖3所示，為期16天的培養監測中，生物量濃度持續增加，直至CO2供應被關閉。圖中可觀察到五個不同的生長階段：

首先是滯后的指數生長期（i.），之后是三個不同的線性生長期（II.至IV.），最后是CO2耗盡后進入的死亡階段（V.）。pH和葉綠素信號的變化過程與觀察到的生長階段相關。在整個實驗過程中，散射光信號的平均變異系數為5.2%，因此可在建議的設置中進行平行光營養培養。離線樣本驗證了在線信號的準確性。235小時后采樣（此時由于短暫暴露于大氣中的CO2濃度中，pH值升高），離線OD750值為40，離線pH值為7.3，這與在線測定的pH值7.2高度一致。在實驗結束時，離線OD750值為60左右，表明在實驗過程中培養物生長旺盛導致產生較高的生物量濃度。

結論

光照模塊的加入為BioLector開創了全新的應用領域。本文應用案例中所介紹的幾種濾光片模塊，可準確監測關鍵的光營養培養參數，如生物量濃度、葉綠素含量和pH值。

葉綠素熒光濾光片模塊在低濃度生物量測定中具有良好的分辨率，與在高細胞密度下準確的散射光測量相得益彰16。此外，研究證明，基于HPTS的pH測定法是替代optode測量的理想解決方案，即便在連續照明的條件下，該方法也同樣適用。

小球藻的長期培養證實，BioLector系統可用作并行、高通量培養的微升級光照生物反應器。此外，經專門設計的濾光片模塊可評估培養物生長的在線信息，并揭示不同的生長階段。

這些結果證實該平臺可通過不同方式優化各種應用的光營養培養。精心設計的光照模塊，支持在不同照明條件下設置較寬的光譜和輻照度范圍，以便優化照明條件。多篇文獻已報道這些照明特性可影響藻類生長9,17-21。

在BioLector XT中，可通過氣體流量和氣體成分改變實驗的氣體培養條件，這是光營養培養中的一個重要參數，例如，CO2富集可獲得更高的生物量濃度1,19。其他影響微藻培養的關鍵因素包括溫度22,23、pH1,20、鹽度24、碳源25-27、氮源19,27和培養基成分28。BioLector XT可優化所有這些參數。此外，建議采用分批補料培養來提高脂質產量29。由于監管限制，有關基因工程藻株潛力的研究和應用極少，但藻株經基因改造，可能具有更高的生長速率和細胞密度，更高的生產速率或滴度，更強的魯棒性或更好的太陽能-生物量轉換效率和光合生產力30,5,31,32。

所有這些因素均可通過搭載LAM的BioLector XT微型生物反應器進行研究和優化，助力研究人員加快研究進程，為實現藻類潛能所需的答案提供幫助。

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