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慢病毒載體（Lentivirus Vectors, LVV）是一類由類逆轉(zhuǎn)錄病毒（Lentivirus）衍生的病毒載體，廣泛應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviruses）是一類能夠?qū)⑵浠蚪M整合到宿主細(xì)胞DNA中的病毒，這種特性使得它們非常適合作為基因傳遞工具。在這些逆轉(zhuǎn)錄病毒中，人類免疫缺陷病毒（HIV）及其衍生病毒最為知名，后者被用作為制作LVV的基礎(chǔ)。與常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，Lentivirus具有能感染靜止細(xì)胞的能力，因此能高效地將外源基因傳遞給細(xì)胞，從而在基因治療中發(fā)揮重要作用。

LVV主要通過重組技術(shù)從HIV等病毒中提取并修改其基因組，以去除病毒的致病部分并引入目標(biāo)基因，使其能夠安全、有效地傳遞遺傳物質(zhì)。這些載體已被用于多種臨床試驗(yàn)中，尤其是對于遺傳性疾病的治療和癌癥免疫療法的研究。與其他病毒載體（如腺病毒或腺相關(guān)病毒）相比，LVV具有以下優(yōu)勢：

1長期表達(dá)

LVV能夠?qū)⒒蛘系剿拗骷?xì)胞的基因組中，提供長期的基因表達(dá)。

2高效傳導(dǎo)

由于其能夠感染多種類型的細(xì)胞，尤其是非分裂期的細(xì)胞，LVV在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有較高的效率。

3廣泛適用性

LVV適用于多種哺乳動物細(xì)胞，包括人類細(xì)胞，是許多基因治療策略中最常見的載體之一。

LVV載體結(jié)構(gòu)

然而，LVV的生產(chǎn)過程中仍面臨許多挑戰(zhàn)，尤其是在病毒顆粒的純化和表征方面。生產(chǎn)LVV時，通常需要高效的病毒顆粒分離和純化技術(shù)，因?yàn)檫@些病毒載體往往和其它雜質(zhì)（如病毒宿主細(xì)胞雜質(zhì)、未包裝的病毒蛋白、外源基因產(chǎn)品等）混雜在一起，這些雜質(zhì)可能影響最終的產(chǎn)品質(zhì)量，甚至產(chǎn)生不良反應(yīng)。鑒于LVV對病毒顆粒的質(zhì)量和純度要求較高，開發(fā)可靠的分析技術(shù)來表征這些顆粒變得至關(guān)重要。

作者評估了幾種顆粒表征技術(shù)在分析兩種不同生產(chǎn)工藝下制造的LVV產(chǎn)品中的應(yīng)用。具體而言，研究關(guān)注的是來自懸浮培養(yǎng)工藝（材料1）和貼壁培養(yǎng)工藝（材料2）的LVV樣品。研究的目標(biāo)是評估動態(tài)光散射（DLS）、成像光學(xué)顯微鏡（ILM）、納米顆粒追蹤分析（NTA）、微流脈沖納米分析技術(shù)（MRPS）和沉降速度分析超速離心（SV-AUC）等五種分析技術(shù)在粒徑分布、純度以及顆粒雜質(zhì)存在的表征中的有效性。

材料1的p24 ELISA滴度是材料2的三倍，表明材料1每毫升包含的病毒顆粒更多。然而，材料1的渾濁度較高，說明其中含有較多的大顆粒雜質(zhì)。相對而言，材料2的渾濁度較低，雜質(zhì)較少。兩種樣品在分析前都需要進(jìn)行稀釋，其中材料1的稀釋倍數(shù)較大，因?yàn)槠錅啙岫容^高。

材料1和2

分析技術(shù)的比較評估

DLS：動態(tài)光散射（DLS）作為一種廣泛應(yīng)用的顆粒大小分析技術(shù)，在LVV樣品的表征中面臨困難，尤其是樣品的多分散性和顆粒雜質(zhì)影響了數(shù)據(jù)的可靠性。該方法生成了寬泛的、未分辨的粒徑分布峰，無法準(zhǔn)確測量LVV顆粒的大小，特別是在顆粒雜質(zhì)較多時。因此，DLS并不適合分析這些復(fù)雜樣品。

ILM和NTA：在成像光學(xué)顯微鏡（ILM）和納米顆粒追蹤分析（NTA）中，材料1的粒徑分布表明存在較多的大顆粒雜質(zhì)，尤其是在未過濾的樣品中。雖然過濾去除了部分大顆粒，但小顆粒雜質(zhì)仍然影響結(jié)果。ILM分析顯示，材料1過濾后，顆粒濃度減少了約50%，粒徑分布有所變化，這表明通過過濾去除了較大的顆粒。然而，由于儀器的低敏感性，ILM在較小顆粒的檢測上存在局限，容易出現(xiàn)誤解。NTA提供了比ILM更可靠的數(shù)據(jù)，但仍然難以區(qū)分LVV顆粒和雜質(zhì)，尤其是在復(fù)雜、寬分布的材料1樣品中，LVV顆粒與雜質(zhì)難以區(qū)分。

MRPS: 微流脈沖納米分析技術(shù)（MRPS）在過濾后的樣品中表現(xiàn)良好，能夠更準(zhǔn)確地測量材料2的顆粒大小分布。然而，未過濾的材料1在MRPS分析中導(dǎo)致了卡管現(xiàn)象，使得該技術(shù)在未過濾的材料1樣品中不適用。雖然MRPS能夠成功表征材料2中的LVV顆粒，但在材料1中，小顆粒雜質(zhì)與LVV顆粒重疊，需要通過手動數(shù)據(jù)處理才能分辨出LVV的峰值。

SV-AUC：沉降速度分析超速離心 (SV-AUC) 是一種有前景的LVV表征技術(shù), 在所有測試的技術(shù)中， SV-AUC表現(xiàn)出了最好的結(jié)果，特別是對于含雜質(zhì)較少的材料2。SV-AUC能夠通過沉降系數(shù)分離不同粒徑的顆粒，這對于分析具有不同粒徑的顆粒混合物非常有優(yōu)勢。通過對樣品施加離心力，SV-AUC能夠根據(jù)顆粒沉降速度提供清晰的顆粒分布圖譜。作者研究發(fā)現(xiàn)，SV-AUC通過在7,000 rpm下進(jìn)行離心，成功檢測到了材料2中的LVV顆粒，并揭示了一個沉降系數(shù)約為650 S的峰值，這與文獻(xiàn)中報道的逆轉(zhuǎn)錄病毒的沉降系數(shù)（600 S）相符。這一發(fā)現(xiàn)表明，SV-AUC在LVV顆粒的表征中具有很高的特異性。

SV-AUC的兩步離心方法進(jìn)一步提高了分辨率。在第一步中，使用7,000 rpm的中速離心來分離LVV顆粒和大顆粒雜質(zhì)。在第二步中，采用更高的離心速度（42,000 rpm）來更好地分離較小的雜質(zhì)，包括人白蛋白等蛋白質(zhì)。這種雙重離心方法使得研究能夠在同一實(shí)驗(yàn)中分離出LVV顆粒和更小的雜質(zhì)顆粒。從SV-AUC獲得的沉降系數(shù)分布顯示，材料2中在650 S左右有一個清晰的峰值，并且A260/A280的比值為1.3，這表明該峰值很可能對應(yīng)于LVV顆粒，符合LVV顆粒通常由核酸和蛋白質(zhì)組成的特點(diǎn)。這一結(jié)果驗(yàn)證了SV-AUC作為一種可靠的LVV顆粒表征方法的有效性，尤其在純凈的樣品中具有良好的適應(yīng)性。

AUC分析結(jié)果

總結(jié)和展望

盡管SV-AUC在材料2中表現(xiàn)出了良好的分辨能力，但在材料1中，由于存在大量大顆粒雜質(zhì)，導(dǎo)致LVV顆粒被淹沒，因此難以準(zhǔn)確分辨出LVV顆粒。SV-AUC作為一種強(qiáng)有力的粒徑分布表征技術(shù)，在分析LVV顆粒時具有顯著優(yōu)勢，尤其適用于雜質(zhì)較少的樣品。SV-AUC能夠基于沉降系數(shù)分離病毒顆粒，結(jié)合雙步離心方法，可以準(zhǔn)確檢測LVV顆粒并與雜質(zhì)區(qū)分開來。盡管在更復(fù)雜的樣品中，SV-AUC的應(yīng)用仍然面臨挑戰(zhàn)，但它為LVV產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了一個有前景的解決方案。未來，改進(jìn)樣品制備技術(shù)，如選擇性去除雜質(zhì)或富集LVV顆粒，可能會進(jìn)一步提高SV-AUC在日常應(yīng)用中的適用性。

參考文獻(xiàn)：

Stadler D, Helbig C, Wuchner K, Frank J, Richter K, Hawe A, Menzen T. Challenges in the analysis of pharmaceutical lentiviral vector products by orthogonal and complementary physical (nano)particle characterization techniques. Eur J Pharm Biopharm. 2024 Jul;200:114340. doi: 10.1016/j.ejpb.2024.114340. Epub 2024 May 24. PMID: 38797222.