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1引言

生物制藥制造涉及復雜的工藝步驟，嚴格的生產條件能最大限度地提高生物產品的產量、純度和質量。近年來，過程分析技術(PAT)越來越多地被用于實時監控關鍵的過程和性能參數。PAT技術能更好地控制生產條件，工藝流體中的溶液濃度是許多生物處理步驟中實現成品質量一致性所需的重要參數。

2濃度測量的關鍵需求

許多生物制藥制造工藝步驟需要測量溶液中溶質的濃度。對于上游過程，進料和生物反應器中成分的濃度對于細胞代謝和生長非常重要，同時要確保可重復操作；在下游過程中，需要大量的溶液(包括緩沖液)來進行層析和超濾/透析(UF/DF)步驟。制備不當的溶液可能會對下游過程產生嚴重的負面影響(例如，產品無法與色譜柱結合或不正確地配制原料藥)。

因此，溶質濃度的測量是溶液制備過程中的一個關鍵步驟，確保溶液在引入過程之前已經被正確地配制。此外，在色譜運行期間，通過對溶液進行在線監測，可以提供用于生成鹽梯度的輸入控制參數，進行在線稀釋緩沖液，并監測在色譜運行的每個步驟(例如平衡、洗滌和洗脫)中是否使用了正確的溶液。

工藝過程中流體濃度的測量在清潔操作中十分重要，對清潔液進行濃度測量以確定清潔溶液中酸、堿或清潔劑濃度是否處于適當水平。未進行該測量可能會導致清潔不充分、系統組件損壞以及系統停機時間延長。濃度測量還用于監測清潔過程所需要沖洗系統的水中的溶質濃度，可以檢測清洗過程中清潔劑是否完全去除。

3濃度測量技術概覽

要讓生物制藥制造商完全相信上游和下游生產過程中使用和產生的工藝流體是符合規定的濃度，擁有易于使用、有效且高效的濃度測量方法非常重要。理想的技術必須是可靠的，并且提供高精度和可重復性以及快速響應時間。

電導率

電導率是衡量溶液傳導電流能力的指標(1)。它可以通過在電極之間施加電壓，測量產生的電流，并確定溶液的電阻率(由此計算電導率)來測量。溶質在溶液中導電的程度取決于其離子特性和濃度。因此，測量電導率是確定離子溶液濃度的好方法。

但是這種方法在測量含有非離子和弱離子物質的溶液濃度的能力方面受到一定限制，包括許多生物處理溶液中的成分。使用電導率來精確測定許多生物制藥溶液中成分的濃度相對困難。

pH

溶液的pH值是衡量溶液酸度或堿度的指標。具體來說，pH值測量水合氫離子的濃度(2)。因此，它是解離時產生水合氫離子的物質的水溶液濃度的有效指標。

但對于不產生水合氫離子的工藝流體，它的用途有限。

滲透壓

滲透壓是一種基于由于給定溶質(3)的存在而導致的溶液凝固點變化(或凝固點降低)的濃度測量方法。溶質使溶液的凝固點降低到比純溶劑的凝固點低的值。

一般情況下，溶質濃度越大，凝固點降低越大;因此，濃度的大小與抑制程度相關。與電導率和pH值通常用作在線技術不同，滲透壓是一種離線測量技術，不能提供實時信息。

折射率

折射率:當光線從一種介質進入另一種介質時，由于光在每種介質中傳播速度的變化，光線會彎曲成一定角度。一種介質的折射率(IoR)是真空中的光速與該介質中的光速之間的比率(4)。不同濃度的溶質溶液具有不同的折射率。因此，確定溶液的IoR可以直接測量溶液的濃度。

在傳統的折射計中，光源照射在樣品上，然后光線穿過溶液。這樣，分析人員就可以確定光的傳輸。然而，使用這種方法的結果可能會受到溶液中的濁度以及光的衍射和吸收的影響(1)。

一種較新的使用發光二極管(LED)反射IoR技術。來自LED的光線照射到光學窗口上，該光學窗口與待分析的工藝流體或產品溶液接觸。光在臨界角(θc)反射出光學窗口，在那里它被折射到流體。這個角度可以通過使用光電二極管陣列探測器分析反射光來確定。臨界點取決于溶液濃度。因此，分析人員可以迅速檢測到濃度的變化。使用這種方法測試的結果不受溶液濁度或衍射和光吸收的影響。

與電導率和pH值不同，溶液的折射率與它的電荷情況或酸性無關。由于該技術可以非常快速地確定溶液的IoR，所以適用于實時數據的在線分析，可以對工藝變化立即做出響應。此外，IoR監測很容易從實驗室擴展到商業生產，而不會對精度有所損傷。這使得該技術適用于需要濃度監測的生物制藥應用。

4研究目的、材料和方法

這項研究的主要目的是比較電導率、IoR和滲透壓的性能，以測量生物制藥生產中經常使用的不同類型溶液的濃度。北卡羅來納州立大學的生物制造培訓與教育中心(BTEC)進行了這項分析技術評估。

為了評估，我們準備了幾種生物制藥加工中常用的不同水溶液(表1)。我們測量了每種溶液的電導率、IoR和滲透壓。我們選擇的溶液包括一系列不同濃度的含有不同溶質的液體。這些溶質可分為離子型、非離子型和有機緩沖液。我們在生物制藥過程中可能使用的pH值條件下制備有機緩沖溶液，不需要調整pH值。

對于每種溶液，我們分別使用220型電導率儀(Denver Instruments)、BT128型IoR濃度監測儀(Entegris)和3320型微滲透儀(Advanced Instruments)測量電導率、折射率和滲透壓。我們繪制了每種測試方法(電導率，IoR和滲透壓)對每種溶液濃度的響應。線性響應是一個重要的方法屬性，因為它允許簡單地量化溶液濃度。因此，我們使用響應的線性度來評估方法的有效性。

5結果與討論

我們將在下面討論實驗結果。

離子濃度

圖1：NaCl：電導率和折射率性能

圖2：NaCl：滲透壓和折射率性能

表1：進行濃度分析的溶液

圖1和圖2顯示了NaCl溶液在0.1M到2 M濃度范圍內的結果，每種方法都給出了合理的線性響應。但是，由于樣品的凝固點過低(超出了本研究所用的滲透計的測量范圍)，高濃度NaCl(2M)溶液的滲透壓無法測定。

我們對氫氧化鈉溶液進行了類似的測量(數據未顯示)。然而，與NaCl的結果一樣，NaOH(2 M)的最高濃度的滲透壓超出了滲透計的范圍。此外，2M NaOH的電導率也超出了量程(300 mS/cm)的范圍。因此，無論是電導率還是滲透性都無法提供所研究的濃度范圍內的讀數。相比之下，IoR在整個濃度范圍內呈線性響應。

非離子溶液

圖3：乙醇：電導率和折射率性能

圖4：乙醇：滲透壓和折射率性能

圖3和圖4顯示了乙醇溶液的電導率、IoR和滲透壓測量。沒有一種檢測方法在研究的濃度范圍內(10-75v/v)提供完全線性響應。然而，IoR方法提供了三種測試方法中最好的結果。正如預期的那樣，乙醇溶液的電導率值相當低，與濃度不是線性相關。當酒精濃度≥0.25 v/v時，溶液不結冰。所以我們無法確定它們的滲透壓。與離子溶液一樣，IoR在整個濃度范圍內具有最佳的線性響應。

對聚山梨酯80溶液的測量結果與乙醇溶液相似。在0.5-5v/v濃度范圍內，聚山梨酸酯80溶液的IoR和滲透壓測量值呈線性(數據未顯示)。與乙醇的結果不同，聚山梨酸酯80的電導率和濃度的圖根據線性最小二乘擬合的決定值系數顯示出一定的線性。由于聚山梨酯80是非離子型的，這個結果是出乎意料的。然而，測量的電導率值較低(均為5μS/cm以下)，在這個低范圍內的測量精度相當低。

有機緩沖液

圖5：Tris 無 pH調節：電導率和折射率性能

圖6：Tris 無 pH調節：滲透壓和折射率性能

圖7：Tris pH值8：電導率和折射率性能

圖8：Tris pH值8：滲透壓和折射率性能

在不同的pH值下，3種有機緩沖液(2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、2-氨基-2-羥甲基丙烷-1，3-二醇(Tris)和2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES))的測定結果相似。圖5-8顯示了未調整和調整到pH 8的Tris溶液的數據。在10-500 mM的濃度范圍內，pH為8的Tris溶液對所有測量方法都呈線性響應。值得注意的是，在沒有調整pH的情況下，電導率和濃度之間的關系不是線性的。這些有機緩沖液只是弱離子的，在低電導值時，準確度和精密度會受到影響。用酸調節pH到8，此時的Tris溶液的電導率數據與濃度呈線性關系，這是由于調節pH用的酸的關系（HCl）

表2：本研究中獲得的折射率、電導率和滲透壓數據的決定系數

表2總結了所使用的每種分析方法的決定系數(R2)。R2是數據與擬合線性回歸線的接近程度的統計度量(5)。該表清楚地表明，電導率是確定離子溶液和有機緩沖液濃度的合適方法。然而，這不是一種適合于測定非離子溶液濃度的方法。

表2中的結果還表明，雖然滲透壓適用于本研究評估的大多數溶液，但由于缺乏凍結，較高的溶質濃度可能導致滲透壓值不確定。還應該注意的是，滲透壓是一種離線方法，不能用于在線分析。值得注意的是，表2表明，在所有濃度下，只有IoR對所有溶液都有線性響應。

我們觀察到所有方法都有良好的精度，盡管導電性能測試的重復性略低于IoR和滲透性測試，特別是在低導電性能值時。具體來說，電導率測量需要頻繁校準，讀數穩定需要時間。

6有效的濃度測量與IoR法

生物制藥生產中的質量控制是生產安全有效的生物藥物的關鍵。生物制藥生產中使用的工藝流體的準確濃度測量對于確保一致的加工，產品質量和產量至關重要。在線PAT方法的開發提高了公司實時監測和控制生物過程的能力。

對于濃度測量，本研究表明IoR技術優于傳統的濃度測量方法，如電導率和滲透壓。IoR方法對所有測試溶液的濃度都產生了優秀的線性相關性。由于IoR能夠對生物制藥生產中常用的許多不同類型的試劑在更寬的濃度范圍內進行有效的實時濃度測量，具有很高的準確度和精度，因此，它在實時在線測量工藝流體濃度方面具有很大的潛力。

參考資料