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常規高通量測序的文庫構建，需要PCR擴增。主要是為了對微量DNA樣本進行擴增，提高庫容；另一方面，放大核酸熒光信號，提高測序準確度。然而，PCR擴增同樣也有著無法忽視一些問題：

1.      擴增過程中產生復制錯誤，累積下去，產生假陽性；

2.      擴增會有一定的偏好性，比如GC含量異常的區域和二級結構等區域，擴增效率低，難以覆蓋；

3.      擴增的循環數越多，重復率（Duplication）越高，造成測序成本增加、浪費測序數據。

什么是PCR-Free技術

常規擴增建庫有諸多問題，那么PCR-Free技術也就營運而生。PCR-Free技術，相較于常規建庫，其建庫步驟為：基因組片段化-末端修復-加接頭-純化-文庫質控，省去了PCR擴增的步驟。

1.      PCR-Free建庫技術：

2.      省去擴增步驟，縮短建庫時間；

3.      避免使用高保真聚合酶，降低建庫成本；

4.      減少擴增產生的復制錯誤；

5.      避免擴增偏好性；

6.      避免擴增產生的Duplication，降低測序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫即運用了PCR-free的建庫方式，并同時采用創新型鏈接在磁珠上的轉座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結合到一個簡單快速的反應中，實現WGS高度均勻的覆蓋。

針對PCR-Free建庫方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫構建自動化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標準投入量（100-2000ng）gDNA進行建庫，同時進行96例樣本的建庫。

·        減少手動操作時間

·        減少系統設置何潛在的移液錯誤

·        標準化工作流程改進實驗結果

·        快速安裝

Biomek i7工作站

圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭；

·        靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配；

·        96通道可選擇上一列、一行、多行等不規則形狀排列吸頭，實現不定樣本數液體轉移；

·        斜側抓板機械手可360度旋轉，輕松實現臺面全覆蓋；

·        多達45個工作板位；

·        可實現震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能；

·        開放式工作桌面，可輕松整合外部設備，如（自動PCR儀）。

圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動化工作流

使用Biomek i7工作站進行 Illumina PCR free文庫構建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來進行

表1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動化Illumina PCR free流程預估時間（大于100ng gDNA投入）

Method Options Selector (MOS）

MOS能夠選擇樣本數量、投入量、Index開始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應性和方法執行的簡易性。

圖3. Illumina PCR-Free建庫方法選項選擇器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中選擇的選項生成的，并提供用戶特定的圖形設置說明，包括試劑體積計算和準備試劑的分步說明。

圖4. 引導式實驗室設置提供配方注釋，指示試劑量（上圖），

并指導用戶正確設置平臺（下圖）

DeckOptixFinal Check (DFC)

在開始運行自動化流程之前，BML中的DFC功能，會通過實時拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設置錯誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯誤。

實驗設計

為了證明在i7雙雜交工作站上進行96個樣品文庫制備的能力，我們從人細胞系NA12878 gDNA制備文庫。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個gDNA樣本以及陰性模板對照（NTC）隨機放入96孔板，如下所示。

實驗結果

·        隨機挑取了23個 gDNA文庫進行測序，平均插入片段為483bp±28bp

·        Reads mapping率為96.8%，標準偏差為0.1%

Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文庫制備自動化是一個完全獨立的解決方案，為任何規模的實驗室提供了高效、靈活和可擴展的解決方案。自動化解決方案提供的文庫在下游工作流程中產生高質量的結果，并節省了寶貴的時間和金錢。