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【巴爺爺?shù)牟┛汀咳绾巫屇牡鞍踪|(zhì)配方穩(wěn)定更持久？

步琦 2022-02-17 | 閱讀：1017

不管您是要建立一座沙堡、一個核反應(yīng)堆還是一段新的戀情，亦或是一種新的蛋白質(zhì)配方，穩(wěn)定持久都是非常重要的指標。因此，我將兌現(xiàn)之前的承諾完成蛋白質(zhì)配方系列文章；在這個系列中，我會深入研究噴霧干燥和冷凍干燥方法在蛋白質(zhì)和多肽中的應(yīng)用。本篇文章可以學(xué)習(xí)到更多關(guān)于如何使用這些技術(shù)方法來實現(xiàn)如何確定穩(wěn)定的蛋白質(zhì)配方。

最近，我看了一部關(guān)于堅固人造建筑的紀錄片，例如胡佛水壩（Hoover Dam）和梅厄塔（Torre Mayor）。顯然地，梅厄塔不僅在2003年的7.6級地震中幸存下來，當(dāng)時在里面的工作人員甚至沒有注意到顫動。

工程師們喜愛穩(wěn)定，科學(xué)家們也是一樣。每當(dāng)我們進行蛋白制劑干燥時，就像那些工程師和建筑師一樣，我們最關(guān)心的是如何實現(xiàn)產(chǎn)品的長久穩(wěn)定性。通常配制的小分子制劑中水分含量足夠低，所以可以不添加賦形劑就能讓配方在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。

另一方面，蛋白質(zhì)要比多肽更加不穩(wěn)定；它的穩(wěn)定性與其構(gòu)象結(jié)構(gòu)和配方含水量都密切相關(guān)。蛋白制劑需要保持一定水分含量來避免變性，因此需要優(yōu)化蛋白質(zhì)配方和控制干燥工藝避免出現(xiàn)穩(wěn)定性問題。在某些案例中，干燥過程中的蛋白質(zhì)甚至?xí)兊煤懿环€(wěn)定，但如果沒有發(fā)生聚合等不可逆反應(yīng)，蛋白質(zhì)仍可以完全再折疊，并在重構(gòu)后表現(xiàn)出合適的藥物穩(wěn)定性。

一個精心設(shè)計的配方要考慮到分子特異性、過程中干燥應(yīng)力、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和純化的方法以及分子的降解途徑。當(dāng)然，接下來是確定蛋白質(zhì)配方的技術(shù)參數(shù)：

通過噴霧干燥進行配制蛋白質(zhì)制劑

噴干蛋白質(zhì)樣品高度依賴樣品性質(zhì)、儀器設(shè)計和過程參數(shù)設(shè)定。

影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的因素有：

* 形態(tài)

* 殘留水分

* 顆粒大小

為減少蛋白質(zhì)配方中蛋白質(zhì)或多肽的熱降解，應(yīng)該多關(guān)注溫度和滯留時間。各參數(shù)中出口溫度是防止熱降解的關(guān)鍵所在。

當(dāng)出口溫度低于蛋白質(zhì)的降解溫度時，物質(zhì)所經(jīng)受的熱降解就會降低。但是出口溫度過低會使殘留水分增加，從而導(dǎo)致貨架期縮短。所以重要的是找到理想的出口溫度，既可以讓樣品變?yōu)楦稍锓勰植粫鸬鞍踪|(zhì)配方的降解。

通常，生物制藥的蛋白質(zhì)噴霧干燥其出口溫度要低于100 ℃，同時進料速度都很低。

滯留時間對于最小化熱敏性樣品的熱降解非常重要。表面水分含量高的細小顆粒噴霧更容易進行蒸發(fā)，所以他們的滯留時間很短；低水分含量的細小至半粗糙的噴霧，需要中等滯留時間；而殘留水分更低的粗糙噴霧，則需要最長滯留時間。

根據(jù)研究報道，10 μm大小的純水液滴蒸發(fā)需要0.03 s，100 μm的液滴需要3 s。

在蛋白質(zhì)配方應(yīng)用中，通常實驗室級噴霧干燥儀的滯留時間在0.2到0.35秒之間。滯留時間根據(jù)干燥室體積和干燥氣體流量決定。由于干燥室體積是恒定的，只有氣體流量可以調(diào)節(jié)。大多數(shù)噴霧干燥儀都以最大干燥氣體流量運行，以保證最大限度的噴干能力。

通過冷凍干燥進行配制蛋白質(zhì)制劑

冷凍干燥過程中最關(guān)鍵的一步是預(yù)凍，因為它決定了干燥產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)。您需要在足夠低的溫度下進行冷凍產(chǎn)品，以使產(chǎn)品完全固化。大多數(shù)液體樣品，包括蛋白質(zhì)配方制劑，都是通過形成冰晶來完成冷凍。冰晶的大小和形狀取決于冷卻速度，并決定了顆粒的凍干能力。

快速冷凍會形成小冰晶，而緩慢冷凍則會產(chǎn)生大尺寸冰晶。在凍干過程中，小冰晶比大冰晶更難以從產(chǎn)品中除去。雖然如此，蛋白質(zhì)制劑的預(yù)凍溫度是由其特性和配方組成決定的。

配方制劑通常有兩種不同的預(yù)凍方式。共晶混合物中包含物質(zhì)的結(jié)冰點要低于周圍的水。當(dāng)共晶混合物進行冷凍時，水因為結(jié)冰會先從這些物質(zhì)中分離出來的。從表面來看，蛋白質(zhì)配方制劑已經(jīng)冷凍，但其中的溶質(zhì)物質(zhì)仍然是液體狀態(tài)。它們會形成濃度集中區(qū)域，最終在低于水的冰點溫度下冷凍結(jié)冰。

當(dāng)混合物中所有組分都被完全凍結(jié)時的溫度稱為共晶溫度，也是蛋白質(zhì)配方制劑的臨界溫度，是其在凍干過程中所能承受的最大溫度。

由于未凍結(jié)的組分會在真空下膨脹，對未完全凍結(jié)的共晶混合物進行抽真空可能破壞樣品。

另一類混合物是無定形樣品，在凍結(jié)時會形成玻璃態(tài)。隨著溫度降低，蛋白質(zhì)配方變得更加粘稠，最終在玻璃化轉(zhuǎn)化點凍結(jié)成玻璃狀固體。對于非晶體樣品，穩(wěn)定性方面的溫度臨界點稱為塌陷溫度，塌陷溫度一般會略低于玻璃轉(zhuǎn)化溫度。通常，無定形樣品的冷凍干燥非常困難。

蛋白質(zhì)是具有相對較高的玻璃轉(zhuǎn)化溫度的分子，因此很容易進行冷凍和干燥。冷凍后，嵌入蛋白質(zhì)的最終結(jié)構(gòu)就形成了。如果結(jié)構(gòu)不正確，蛋白質(zhì)就會鎖定在錯誤的構(gòu)象中可能導(dǎo)致失去活性。因此，冷凍方法(慢vs快)及其對蛋白質(zhì)完整性的影響非常重要。

通常對于初級干燥來說，您可以通過玻璃轉(zhuǎn)化溫度來確定擱板溫度和干燥室壓力，用以設(shè)定凍干循環(huán)參數(shù)。凍干處理的階段時間可以使用工具確定，例如終點判定(溫度和壓力)或科學(xué)的知識經(jīng)驗。

初級干燥是利用分子熱特性來進行的，而次級干燥循環(huán)則是利用分子熱穩(wěn)定性來進行。

擱板溫度和凍干時間會影響產(chǎn)品活性。次級干燥也決定樣品的殘留水分等級，從而決定了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和保質(zhì)期限。在產(chǎn)品保質(zhì)期限內(nèi)殘留的水分會促使降解反應(yīng)發(fā)生，所以應(yīng)保持在一個較低的水平，通常殘留含水量低于 3 %。

為您的蛋白質(zhì)配方制劑提出一些建議：

* 蛋白質(zhì)和多肽需要儲存在 -80 ℃ 環(huán)境中，不建議在 -20 ℃。在儲存之前，必須要過濾純化的蛋白質(zhì)成分。使用干冰/乙醇混合物來快速冷凍比在 -20 ℃ 環(huán)境下慢凍要好。為了增加儲存、凍融周期過程中的穩(wěn)定性，可以考慮在混合物中加入蔗糖或甘油。謹慎選擇蛋白質(zhì)制劑的溶劑，可以考慮使用保護劑，如海藻糖，用以穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)并幫助保持產(chǎn)品功能活性。

* 如果可以的話，請測量出蛋白質(zhì)的降解溫度，或者也可嘗試測定蛋白質(zhì)配方制劑（蛋白質(zhì)+輔料）的玻璃轉(zhuǎn)化溫度。

* 在蛋白質(zhì)配方中添加糖和糖類添加劑，以保護噴霧干燥和冷凍干燥的蛋白質(zhì)免受脫水和熱應(yīng)激效應(yīng)的影響。

* 考慮蛋白質(zhì)配方設(shè)計是否選擇了合適的干燥方法。對于不適合進行冷凍干燥的蛋白質(zhì)配方，則很難設(shè)計出合適的凍干循環(huán)參數(shù)。例如，磷酸鹽緩沖鹽溶液的蛋白質(zhì)樣品極難進行冷凍干燥處理。

* 為每個樣品開發(fā)和優(yōu)化冷凍干燥方法：一個方法并不適合所有產(chǎn)品。

冷凍干燥前的預(yù)凍方法會明顯影響冰晶結(jié)構(gòu)的形成，進而影響初級干燥和最終產(chǎn)品中水蒸氣的流動。嘗試控制溶液的預(yù)凍凍結(jié)方式，以縮短凍干時間，獲得更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)配方制劑。

希望您可以從這篇文章中了解到相關(guān)的知識，讓我們看看您的蛋白質(zhì)制劑是否和胡佛水壩一樣堅固持久吧！

下次見！