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不同類型化合物應(yīng)用的最佳條件

現(xiàn)如今，F(xiàn)lash 及 Prep HPLC 色譜已經(jīng)成為許多分離應(yīng)用的首選方式。就像我這種“廚房殺手”，黑暗料理界殿堂級人物，在做飯時(shí)，如果鹽放多了都會不禁在想：是不是可以通過色譜分離的方式去除多余的鹽？

然而，盡管這些分離技術(shù)是化學(xué)的基礎(chǔ)，但它們?nèi)匀浑y以捉摸，因?yàn)闆]有通用的一種方法可以適用于所有的樣品。不同行業(yè)研究或感興趣的化合物是多樣性的，這些化合物理化性質(zhì)差異性很大。幸運(yùn)的是，前人們已經(jīng)通過多年的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出了對不同分子類型化合物最有效的純化條件。所以，如果您在進(jìn)行樣品分離時(shí)，對流動相或固定相以及檢測器的選擇感到迷茫時(shí)?；蛟S本篇文章會對您有些許的啟發(fā)。

第一階段是流動相：樣品一定要可溶于待選溶劑；其次是固定相：對您的樣品要有保留。有兩種色譜類型適用于這里：正相（NP）色譜和反相（RP）色譜。這兩大色譜類型也是很多小伙伴在日?？蒲挟?dāng)中用到最廣泛的。接下來是需要確定樣品溶解度，判斷是否可以液體進(jìn)樣？如果不可以，可以考慮固體上樣的方式（Flash色譜）。最后一步是檢測，包括需要了解樣品是否具有紫外吸收，這將決定哪種檢測方法對特定化合物最有效，之前“小步”同學(xué)也有給大家分享過關(guān)于檢測器的選擇，沒有看過的同學(xué)可以點(diǎn)擊這里，為了幫助快速進(jìn)行 Flash 和 Prep HPLC 應(yīng)用的開發(fā)，“小步”同學(xué)給出一些化合物類型適用的最佳條件。

蛋白質(zhì)和多肽

蛋白質(zhì)由氨基酸組成，在溶液中形成與它們的生物功能密切相關(guān)的高度有組織三維結(jié)構(gòu)。多肽則是蛋白質(zhì)的小版本，通常由含有 2-50 個(gè)氨基酸組成。

就流動相而言，它們大多溶于水。反相（RP）色譜法適用于多肽或更小、更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，它們在純化后會重新折疊。這需要含有較少極性溶劑的水混合物，如乙腈、異丙醇或乙醇。乙腈是最受歡迎的溶劑，因?yàn)樗讚]發(fā)，很容易從收集的餾分中去除，除此之外，它還具有低粘度和低紫外線吸收等特點(diǎn)。對于多肽的分離，傳統(tǒng)的三氟乙酸(TFA)被添加到流動相來進(jìn)行pH控制(緩沖)和離子配對(與相反帶電的離子團(tuán)形成復(fù)合物以增強(qiáng)保留)。

固定相是根據(jù)樣品的分子量和極性進(jìn)行選擇。Prep HPLC 色譜法由于其可以搭配更小粒徑尺寸色譜柱（柱效更高），所以成為分離極性相近或相似或化合物的首選純化方法。對于 Prep HPLC 來講，樣品進(jìn)樣方式必須為液體進(jìn)樣。所以對于疏水性樣品，使用低級性溶劑（乙腈），親水性樣品使用乙醇或丙醇最佳。對于高度親水的樣品，可以適當(dāng)?shù)募尤胛⒘慷谆鶃嗧浚―MSO）或二甲基甲酰胺（DMF）提高整體溶解能力，這使得樣品可在最小溶劑體積內(nèi)溶解，最大化減小溶劑擴(kuò)散現(xiàn)象。如果需要使用固體上樣，則更適用于 Flash 色譜。

紫外檢測器通常作為檢測蛋白質(zhì)或多肽最常用的方式，檢測波長一般設(shè)為 280nm。這一波長已被證明特別有用，因?yàn)榭梢灾苯訌牡鞍踪|(zhì)序列當(dāng)中預(yù)測 280nm 處的摩爾吸收系數(shù)(消光系數(shù))，當(dāng)然，這只適用于含有色氨酸或酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)。如果芳香族氨基酸含量低或沒有芳香族氨基酸，則推薦使用 205nm 作為檢測波長。

天然產(chǎn)物/提取物

活的有機(jī)體，如植物、微生物或動物，通過初級或次級代謝途徑產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物。初級代謝產(chǎn)物是生物體生長所必需的，次級代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物的最終產(chǎn)物。

流動相的選擇基于提取時(shí)所使用的溶劑類型，如果采用正相色譜（NP）純化，則使用正己烷，石油醚，二氯甲烷（DCM），乙酸乙酯（EtAc），或其他與水不互溶的溶劑；反相色譜（RP）則采用乙醇和水進(jìn)行提取，分離純化流動相一般為甲醇/水或乙腈/水。對于固定相來說，所有的 NP（硅膠，二醇基，氨基等）和 RP（C18 等）均可被使用。

天然產(chǎn)物的樣品成分通常非常復(fù)雜，所以往往需要采用組合分離技術(shù)：通過 Flash 色譜進(jìn)行前期預(yù)處理粗分，再經(jīng)過 Prep 色譜對樣品進(jìn)行單體化合物分離。

樣品的載樣量取決于天然產(chǎn)物提取物的體積，通常來講提取物量都比較大。樣品可以通過注射器或注射泵的方式注入到 Flash 色譜柱中，如果樣品體積過大，則建議采取固體上樣的方式，因?yàn)槿绻軇w積過大會導(dǎo)致色譜峰譜帶變寬，進(jìn)而影響分辨率。Flash 色譜預(yù)分離的樣品后續(xù)可以在 Prep 上進(jìn)一步純化。

天然產(chǎn)物樣品的多樣性和未知性決定了其被檢測的方法。通常來講，蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）與紫外檢測器（UV）的組合可以最大化保證樣品檢測的全面性。對于 NP 色譜，建議使用二極管陣列檢測器（DAD）來對樣品進(jìn)行檢測。

碳水化合物

碳水化合物可分為低分子量(單糖和雙糖)和更復(fù)雜的重碳水化合物(寡糖和多糖)。

單糖（葡萄糖）

二糖（蔗糖）

多糖（直鏈淀粉）

碳水化合物都是親水性的，流動相一般選擇水/甲醇或水/乙腈進(jìn)行搭配作為洗脫劑。在 RP 條件下，使用 C18 填料作為固定相可以降低高極性碳水化合物的保留。相反，氨基柱已經(jīng)被證明是最適合作為分離碳水化合物的固定相。因?yàn)樗幌?C18 那么非極性。

上樣方式方面，碳水化合物在 RP 條件下通常是可溶的，所以一般采用液體進(jìn)樣的方式進(jìn)行上樣。

碳水化合物和脂類一樣，缺乏發(fā)色團(tuán);目前，ELSD 是主要的檢測方法。傳統(tǒng)上使用示差折光檢測器（RI)，低波長 UV (190-205 nm)，并通過薄層色譜進(jìn)行純化后分析。

小分子藥物

這些化合物被定義為有機(jī)化合物，通常通過有機(jī)合成的方式獲得。具有基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的小分子，分子量一般在 0.1-1kDA 之間。

Flash 和 Prep HPLC 通常都可以在 NP 和 RP 條件下條件。小分子藥物的目標(biāo)通常是使用 RP，因?yàn)閷λ鼈儊碚f水溶性是至關(guān)重要的。NP 只能在 RP 不可能的情況下使用或后續(xù)通過結(jié)構(gòu)修飾等方式使其能具有更高的成藥性。

下表為正相色譜（NP）與反相色譜（RP）的對比：

上樣方式由樣品的極性和純化方式有關(guān)，高壓不銹鋼柱和 Flash 色譜柱可以液體和固體上樣（只能 Flash 色譜使用）。液體注射進(jìn)樣是首選的方式，但是如果樣品在方法的起始流動相梯度時(shí)溶解性不好，則需要采取固體上樣。

檢測器方面，紫外檢測器依然是首選，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的小分子藥物都具有紫外吸收。然而，在某些情況下，如果化合物紫外吸收較弱，那么 NP 色譜所使用的有機(jī)溶劑會給其吸收帶來干擾，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)人員對樣品分離效果的判斷。其他樣品可能會是半揮發(fā)性的?；诖?，在室溫條件下使用 ELSD 檢測器是最適的，因?yàn)楦邷貤l件下有機(jī)試劑的揮發(fā)順帶將化合物帶走的情況時(shí)有發(fā)生，這會導(dǎo)致樣品檢測靈敏度降低。

維生素/脂質(zhì)

由于維生素/脂質(zhì)的性質(zhì)多樣性，以及篇幅原因。我們后續(xù)會專門出一期關(guān)于它們的文章，有相關(guān)研究的小伙伴可以持續(xù)關(guān)注哦。

好了，現(xiàn)在您應(yīng)該知道了不同類型化合物需要使用哪些色譜類型應(yīng)用方法了吧。希望這篇文章能對您接下來的實(shí)驗(yàn)有所幫助！

我是“小步”同學(xué)，我們下期再見！