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【瑞士步琦】【應(yīng)用】冷凍干燥含酵母菌的微球應(yīng)用

步琦 2024-03-25 | 閱讀：581

瑞士步琦

冷凍干燥含酵母菌的微球應(yīng)用

冷凍干燥應(yīng)用

益生菌是一種有益于人體健康的微生物，常被用于改善腸道菌群。微膠囊包埋技術(shù)可以幫助保護(hù)菌株，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存活時(shí)間，不易受外界環(huán)境的影響而失活。因此，在生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品時(shí)，需要考慮選擇合適的微膠囊技術(shù)，以確保益生菌的穩(wěn)定性和活性。下面這篇應(yīng)用非常好的結(jié)合了微膠囊包埋和冷凍干燥技術(shù)，證明菌種經(jīng)過(guò)包埋干燥后仍具有生物活性，為發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性。

介紹

冷凍干燥，也稱為凍干是一種非常通用的脫水方法，常用于保存微生物、食物或藥物，如蛋白質(zhì)類藥物。它將冷凍和干燥結(jié)合在一個(gè)獨(dú)特的操作中，可以創(chuàng)造出高質(zhì)量的干燥終產(chǎn)品。

冷凍干燥通常用于保存微生物培養(yǎng)物，因?yàn)樗哂胁豢珊鲆暤膬?yōu)點(diǎn)：儲(chǔ)存的方便性和增加郵寄微生物的可能性。此外，制得的產(chǎn)品只需要少量維護(hù)，培養(yǎng)基在儲(chǔ)存過(guò)程中不會(huì)受到污染，微生物可以長(zhǎng)時(shí)間保持活力。

然而，眾所周知，冷凍干燥技術(shù)對(duì)微生物至關(guān)重要，因?yàn)樗鼘?duì)微生物的生存能力和生理狀態(tài)都有負(fù)面影響。根據(jù)方法和生物體的不同，微生物存活率也各有不同；然而，活力水平明顯低于液氮儲(chǔ)存 ²。觀察到的活力下降主要是由于一些不良副作用引起的，例如細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成¹、敏感蛋白的變性或在此過(guò)程中膜脂質(zhì)的物理狀態(tài)發(fā)生一些不可逆的變化^3,5。為了防止這種影響，通常在冷凍或冷凍干燥前使用脫脂牛奶、蔗糖、甘油、 DMSO 或海藻糖等作為凍干保護(hù)物質(zhì)^1,3。

據(jù)報(bào)道，海藻糖在干燥、冷凍、滲透脅迫和熱休克等極端環(huán)境下對(duì)酵母和細(xì)菌具有保護(hù)作用。這些保護(hù)效果與膜的穩(wěn)定和酶活性的保存有關(guān)。關(guān)于海藻糖的保護(hù)作用，已經(jīng)報(bào)道了幾種假設(shè)。一些報(bào)道認(rèn)為它的作用是通過(guò)多個(gè)外部氫鍵取代參與維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的水分子，另一些報(bào)道認(rèn)為它形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)以確保物理穩(wěn)定性。

除了發(fā)酵過(guò)程或食品轉(zhuǎn)化，釀酒酵母或乳酸菌等微生物在益生菌膳食食品和飼料補(bǔ)充劑領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。然而，這些應(yīng)用需要在儲(chǔ)存過(guò)程中保持細(xì)胞活力。通過(guò)造粒和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，可以得到大小和組成均勻的無(wú)塵顆粒。由于具有更高的顆粒表面積，這使得產(chǎn)品將具有良好的顆粒流動(dòng)性，更容易掌握的劑量和更快的產(chǎn)品復(fù)原性。盡管存在上述挑戰(zhàn)，冷凍干燥仍然是一種酵母、孢子真菌和細(xì)菌的方便保存方法，因?yàn)樗鼈兊?span style="color: rgb(86, 172, 221); box-sizing: border-box;">長(zhǎng)期生存能力通常保持得相當(dāng)好，而且菌株的儲(chǔ)存和分發(fā)要求也很簡(jiǎn)單。

因此，本應(yīng)用旨在生產(chǎn)釀酒酵母顆粒作為模型微生物，使用微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390 作為造粒機(jī)，將酵母懸浮液擠壓進(jìn)入液氮中形成單分散球體，然后使用冷凍干燥機(jī) Lyovapor? L – 200 進(jìn)行冷凍干燥處理。

儀器，試劑和器材

儀器：

ESCO NordicSafe, Biosafety Cabinet Class II
BUCHI 微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390
BUCHI 冷凍干燥機(jī) Lyovapor^TM L-200 Pro，干燥腔體搭配可加熱擱板
BUCHI Lyovapor^TM Software

試劑：

YPD 培養(yǎng)基, Sigma Aldrich
海藻糖, Sigma Aldrich
脫脂奶粉
瓊脂
去離子水
液氮

器材：

玻璃培養(yǎng)皿
液氮杜瓦瓶

實(shí)驗(yàn)

本應(yīng)用中描述的工作是在無(wú)菌條件下進(jìn)行的。將 84g 市售面包酵母懸浮溶解在 50mL 無(wú)菌 YPD 培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)中。在酵母懸浮液中加入 50mL 無(wú)菌凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基（5g 海藻糖(Sigma Aldrich)和 5g 脫脂牛奶溶于去離子水中），然后用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制粒(表1)。將擠壓后的液滴收集在液氮浴中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到不銹鋼托盤中，保存在 -25°C 的冰箱中進(jìn)行冷凍干燥。

表1：微膠囊包埋參數(shù)

	300μm 噴嘴	1mm 噴嘴
頻率[Hz]	680	60
電壓[V]	750	2500
壓力[mbar]	500	500

冷凍干燥步驟(初級(jí)干燥和次級(jí)干燥)使用 Lyovapor^TM編程軟件，如表 2 所示。使用 Lyovapor^TM L-200 Pro 干燥腔體、可加熱的擱板和環(huán)境空氣。

表2：初級(jí)干燥和次級(jí)干燥凍干參數(shù)

無(wú)酵母菌微球采用與含酵母菌微球相同成分培養(yǎng)基和參數(shù)進(jìn)行制備。

冷凍干燥后，將 1mL 無(wú)菌水加入 1mL 微球中，用以復(fù)原樣品。對(duì)于含有酵母菌的菌珠，對(duì)每個(gè)重組溶液進(jìn)行10倍、100 倍和 1000 倍的連續(xù)稀釋。將復(fù)原后的溶液和稀釋液分別涂于 YPD 瓊脂平板上，如圖 1 所示。瓊脂板在 28℃ 培養(yǎng) 24h，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。

▲ 圖1：瓊脂平板上的酵母活力測(cè)試

結(jié)果與討論

含有酵母的微球可以通過(guò)使用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行包埋制備，結(jié)果表明:用微膠囊造粒儀 B-390 將酵母滴入液氮中，可使酵母迅速顆粒化；用 300μm 的噴嘴和 1mm 的噴嘴分別制備了 700μm 和 1500μm 左右的微球。僅使用含凍干保護(hù)劑介質(zhì)的溶液也得到了類似的結(jié)果。如圖 2 所示，凍干后的微球在形狀和大小上與濕凍微球保持相似。

▲ 圖2：用微膠囊造粒儀 B-390 制得的 300μm 酵母微球，在凍干前（左）后（右）的對(duì)比

通過(guò)掃描電鏡對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在圖 3 中，可以觀察到含有酵母的球珠(下兩圖)和僅由凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基制成的球珠（上兩圖）在形態(tài)上的差異。含有酵母菌的微球具有由 5μm 顆粒組成的粗糙結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為是微生物，而只含有凍干保護(hù)劑的微球具有更光滑的結(jié)構(gòu)。

▲ 圖3：含酵母菌的凍干微球（下）和不含酵母菌凍干微球（上）的結(jié)構(gòu)對(duì)比

當(dāng)冷凍干燥時(shí)，考慮到膜中脂質(zhì)物理狀態(tài)的變化或由于某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，生物系統(tǒng)可能受到破壞^3,9。為了驗(yàn)證酵母菌的活力，將酵母菌重新水合，稀釋，并在 28°C 的 YPD 瓊脂板上培養(yǎng) 24 小時(shí)。圖 4 證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)容，即便失去了部分活力，酵母在凍干后仍然可以生長(zhǎng)^2,4,6,10。

▲ 圖4：在 28℃ 瓊脂板中培養(yǎng) 24 小時(shí)后的酵母菌活力

結(jié)論

含有酵母菌的微粒可以很容易地用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制備，并使用凍干機(jī) Lyovapor^TM L-200 進(jìn)行冷凍干燥處理。B-390 的噴嘴直徑分別為300 μm和1000 μm，制得的微粒直徑分別為 700μm 和 1500μm。冷凍干燥后，珠粒的大小和形狀沒(méi)有變化。該顆粒流動(dòng)性好，容易掌握使用劑量，且與水混合后溶解速度快。凍干后的微生物在貯藏過(guò)程中仍能保持良好的活力，并能在復(fù)水化后成功生長(zhǎng)。

在本應(yīng)用中，造粒包埋和冷凍干燥的結(jié)合顯示出了非常好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。它可以在發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性，有利于生產(chǎn)制備劑量易控制和重組的培養(yǎng)發(fā)酵劑；另外，在益生菌和食品補(bǔ)充劑領(lǐng)域中獲得無(wú)塵且可自由流動(dòng)的粉末，同時(shí)保證產(chǎn)品顆粒大小和組成的均勻度。

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