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概要

有效的顆粒監測策略對于安全生物制劑的開發和生產至關重要，因為這些顆粒可以極大地影響患者的治 療結果。 流式成像顯微鏡(FIM)是一種備受關注的技術，用于確定生物治 療樣品中直徑2 - 100 μm的亞可見顆粒的數量、大小和類型。 

FlowCam Nano將這種分析擴展到更小的亞可見和亞微米顆粒(直徑為300 nm - 2 μm的顆粒)，這是傳統的FIM儀器無法有效成像的粒度范圍。 亞微米FIM允許用戶檢測顆粒源，如API聚集和細菌污染，最初產生的顆粒太小，無法通過傳統成像技術檢測，但如果不解決，可能會聚集成更大的亞可見顆粒。

在本研究中，我們通過使用傳統的亞可見和亞微米FIM分析含有蛋白質聚集體、蔗糖聚集體和大腸桿菌細胞的溶液，展示了FlowCam Nano在生物治 療開發中的應用。 對于每種樣品類型，FlowCam Nano提供了顆粒大小和形狀信息。 

在一項同時進行的研究中，兩臺FlowCamNano也被用來證明其準確檢測細菌相對顆粒濃度的能力。 這些研究表明，FlowCam Nano可以可靠地檢測聚集的顆粒源和細菌污染，而且可能比傳統的FIM應用于更早期的檢測。 

介紹

所有生物制劑都含有顆粒。 顆粒可以有各種來源，如活性藥物成分(API)及其聚集物，容器封閉系統(如硅油滴，玻璃碎屑)，上游處理步驟的污染物，以及其他來源。 雖然這些微粒可以是蛋白藥物的活性成分(例如，細胞藥物產品中的細胞，藥物輸送載體)，但它們通常是雜質，可能會顯著降低治 療藥物的療 效。 建議研究人員在其生物治 療藥物中對顆粒進行特征描述，不僅要滿足諸如USP <788>等法規，而且要確定和控制顆粒形成的來源，并最 大限度地提高其治 療的安全性和有效性。 因此，新的、更靈敏的技術對于確保這些治 療的安全性至關重要。 

流動成像顯微鏡(FIM)是一種日益流行的技術，用于分析生物治 療中的微粒。 像FlowCam這樣的FIM儀器結合了微流體和光學顯微鏡技術，可以快速、大量地自動捕捉圖像。 這些圖像可以用來分析生物治 療樣品中顆粒的濃度、大小分布和形態。 然后，用戶可以將這些信息與正交技術的信息一起分析，從而對樣本質量進行有用的全面評估。 

典型的FIM儀器被設計用于分析直徑大于2 μm的亞可見顆粒(見圖1和表1)。這些亞可見顆粒受到了研究人員的廣泛關注，然而人們對分析生物制藥中傳統成像技術尺寸范圍之外的更小的亞微米顆粒(即100 nm到1 μm之間的顆粒)越來越感興趣。 雖然這些顆粒不直接受USP <787/788>等規則的約束，但在這個尺寸范圍內的顆粒可以聚集或以其他方式促進更大的亞可見顆粒的形成，因而會相關顆相關粒法規規則的監管。 像FIM這樣用于分析這些亞微米顆粒的技術將使得用戶能夠在進一步團聚發生之前及早檢測顆粒產生的來源，如蛋白質和蔗糖的聚集。 此外，一些顆粒的尺寸分布較窄，接近或低于典型FIM儀器的尺寸范圍(如細菌細胞、一些藥物傳遞載體)，需要亞微米聚焦方法才能被檢測。  

圖1:FlowCam Nano和FlowCam 8000系列儀器的尺寸范圍

FlowCam Nano是近年來引入的一種用于檢測和分析亞微米顆粒的新型顆粒分析技術。 該儀器采用了FIM的 專 利改造，采用了基于油浸的光學顯微鏡系統，使用40倍物鏡來捕獲顆粒圖像(圖2)。這使得該儀器能夠檢測到300 nm到2 μm之間的顆粒，這是光學顯微鏡可見的最小物體。 在這個尺寸范圍內的顆粒不僅被傳統的流動成像顯微鏡所忽略，而且用其他的顆粒分析儀器也很難對其進行表征，其中許多儀器要么不是集成技術，要么不提供形態信息。 像傳統的FIM儀器一樣，FlowCam Nano記錄每個顆粒的大小和形態信息，這些信息可以用于識別樣品中亞微米顆粒的類型。 

該儀器使用的淺景深設計是為了最 大限度地提高圖像質量，從而從儀器中獲得形態信息。 雖然這種景深導致一些物體不對焦，從而無法檢測到，但儀器報告的相對顆粒計數樣品之間是一致的，使得FlowCam Nano也能夠用于監測相對顆粒水平。 該設備還可以在校準計數模式下操作，為包含深色、易于檢測的物體的樣品提供精確的顆粒計數，類似于聚苯乙烯乳膠校準珠。FlowCam Nano還保留了典型FIM儀器的高通量和易于使用的優點，允許快速和高效的顆粒成像，特別是相對于手動油浸顯微鏡。 

表1:不同顆粒尺寸的通用定義。FlowCam 8100和其他FIM儀器專注于亞可見顆粒，FlowCam Nano專注于亞微米顆粒。 

為了證明FlowCam Nano在生物治 療開發中的應用，本研究比較了FlowCam 8100檢測到的亞可見顆粒和FlowCam Nano檢測到的亞微米顆粒的大小分布和圖像。 在兩種儀器上分析了治 療蛋白配方中三種潛在的雜質:蛋白質聚集體、蔗糖聚集體和污染細菌。 我們還使用FlowCam Nano來測量不同稀釋度下的細菌培養濃度，以評估儀器的計數性能。 

圖2:油浸式流動成像顯微鏡示意圖，FlowCam Nano使用該技術對亞微米顆粒進行成像  

實驗與方法

材料：牛血清白蛋白(BSA)粉末、蔗糖和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)取自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，MO)。 大腸桿菌培養物來自Carolina Biological Supply (Burlington, NC)。 分別用700 nm和15 μm Duke Standards聚苯乙烯微球聚焦FlowCam Nano和FlowCam 8100。FlowCam Nano的浸泡油來自ibidi(菲希堡，WI)。Micro-90來自International Products Corp. (Burlington, NJ)。 

樣品制備：將含有蛋白質聚集物、蔗糖顆粒和大腸桿菌細胞的樣品置于PBS中進行FIM分析。 制備15ml 1mg / mL BSA PBS溶液，渦流產生蛋白聚集物。 為了生成蔗糖顆粒，將含有5% w/v蔗糖的25ml PBS加熱至37°C恒定攪拌2小時，然后在室溫下孵育過夜。 將大腸桿菌培養物用PBS連續稀釋，獲得含有不同濃度細菌細胞的樣品。 從卡羅萊納生物公司獲得的大腸桿菌培養物用PBS稀釋為1:100，生成含有適當濃度的用于FIM分析的樣品。 然后將這種“儲備”溶液稀釋到1:2、1:4、1:8和1:16，以得到含有不同濃度細菌的樣品。 

流動成像顯微鏡(FIM)：FlowCam 8100和FlowCam Nano (Yokogawa Fluid Imaging Technologies; Scarborough, ME)用于分析前一節中描述的樣品的顆粒含量。 使用VisualSpreadsheet?5.8軟件對兩個FlowCam模型的所有實驗進行儀器操作和數據分析。 兩種儀器都使用內置的自動對焦軟件對聚苯乙烯乳膠校準珠進行了聚焦。FlowCam 8100單元使用15 μm微珠進行聚焦，而FlowCam納米單元使用700 nm微珠進行聚焦。 每個儀器中的流體在測量前用1%的Micro-90溶液清洗，然后在樣品之間用PBS清洗。 

FlowCam 8100配備了10X物鏡、FOV80流單元和單色相機。 以150 μL/min的流速分析1ml樣品。 顆粒檢測采用15個暗像素和15個亮像素閾值，4次閉孔迭代，距離最近鄰4 μm進行分割。 本次分析使用的成像對象為直徑2-10 μm的物體。 

FlowCam Nano配備了40X物鏡、60 μm流量單元和灰度相機。250 μL樣品在25 μL/min流速下進行分析。 每個樣品采用相對計數方式進行分析。 蛋白質聚集體和蔗糖顆粒樣品采用20個暗像素和18個光像素閾值，3次閉孔迭代，距離最近鄰0.1 μm。 考慮到其更透明的顆粒，大腸桿菌樣品采用12光像素閾值、4個封閉孔迭代和1 μm距離進行分割。 每個樣本類型還使用25的邊緣梯度濾波器來去除失焦或其他模糊的圖像。 在儀器尺寸范圍內的所有其他檢測到的物體都用于此分析。 

使用FlowCam Nano和FlowCam 8100對蛋白質聚集體、蔗糖顆粒和大腸桿菌標本進行分析，以比較檢測到的顆粒和兩種儀器報告的大小分布。 在每個儀器上對每個樣品進行三個等分成像。 當在一個單一的FlowCam模型上分析時，從每個樣本類型收集到的所有圖像被匯集在一起，用于估計顆粒大小分布，并為該樣本選擇圖像。 

對含稀釋液大腸桿菌溶液的樣品進行了分析,以評估所檢測出顆粒濃度與樣品溶液實際濃度的比例是線性的。為了評估由于儀器和操作員導致的誤差，在前一節中列出的稀釋劑的大腸桿菌樣本被兩組不同的分析人員分析。對每一組和每一組的細菌細胞濃度進行檢測,實驗時加載400μL樣本進行了測試,并分析了其中的300μL。然后通過線性回歸對產生的稀釋-顆粒濃度數據進行了線性回歸的分析。 

結果與討論

FlowCam Nano和FlowCam 8100比較 

在傳統的FIM儀器(FlowCam 8100)和流式納米儀器上分析了蛋白質的聚集、蔗糖顆粒和大腸桿菌細胞。圖3顯示了每一個FlowCam 8100和FlowCam Nano的每一個樣品的平均粒徑分布。每一個樣本都有類似的粒徑分布(圖3,右柱);在一個特定的大小范圍內,顆粒的濃度隨著顆粒粒度的減小而增加,在每個樣本中檢測到的物體的大部分都是存在于小粒徑范圍內。這種不對稱的尺寸分布表明,每個樣本中包含了許多額外的微粒, 并且對于小于2μm 的顆粒，FlowCam 8100已經接近檢測極限。用FlowCam Nano測量的三個樣本之間大小分布(圖3,左)。對于蛋白質聚合體(圖3、上行)和sucrose(圖3、中行)樣本,FlowCam Nano展現的大小分布與FlowCam 8100具有相同的趨勢：這表明樣品中小顆粒占比更高。 

對于這些樣本, FlowCam Nano檢測到樣本的整體顆粒含量比典型的FIM儀器相對較大。根據這種表現，FlowCam Nano可以在它們產生早期時檢測蛋白質聚集，以研究降解路徑,然后再通過FlowCam 8100產生可以檢測到的可見顆粒。 

圖3:含有蛋白質聚合體(頂部排)、蔗糖顆粒(中行)和大腸桿菌細胞(底部排)的樣本的粒徑分布。使用FlowCam Nano(左)和FlowCam 8100(右)獲得尺寸分布。條形圖表明,在相應的大小箱中,每一種儀器捕獲的顆粒的分數。相應的線圖指示 

與其他樣本不同的是,大腸桿菌(圖3,底部排)顯示了一個大小分布,峰值在1到1.25μm之間,大約是單個大腸桿菌細胞的大小。隨著對顆粒被進一步確認,這些細胞的邊界比分布(圖4)顯示了0.2和0.3之間的峰值,與有機體的邊界比為0.25 (0.5 m厚,2個n長)相一致。尺寸分布表明,在這個樣本中, 是FlowCam Nano檢測到了大腸桿菌細胞的比例。

圖4:通過FlowCam Nano測量的大腸桿菌細胞的顆粒孔比。這個圖的格式與圖2中的大小分布相匹配。 

圖5顯示了兩種儀器的三種顆粒類型的樣本圖像。FlowCam 8100所檢測到的小顆粒通常表現出低細節圖像,這使得區分不同的形態是具有一定困難。相比之下,FlowCam Nano提供了這些小顆粒更詳細的圖像。這些圖像能夠使用戶很容易地將大腸桿菌的圖像與其他顆粒類型區分開來,也可以幫助用戶區分蛋白質聚集和蔗糖顆粒。雖然細菌污染的生物樣本很難使用典型的FIM圖像來檢測,但由于細菌圖像和更常見的蛋白制劑中顆粒物圖像的鮮明對比,可以很簡單地對這兩類顆粒進行區分。

圖5:FlowCam Nano(左列)和FlowCam 8100(右柱)蛋白質聚集(頂部排)、蔗糖顆粒(中行)和大腸桿菌細胞(底部排)的圖像。圖像與其他圖像的圖像近似。每一個顆粒的等效球面直徑值(μm)顯示在它們的圖像下面。 

FlowCam Nano顆粒濃度一致性 

在兩臺FlowCam Nano儀器上對稀釋的大腸桿菌樣本進行了額外的實驗,以評估報告顆粒濃度的相對精度。圖6顯示了上述兩個組在不同稀釋的大腸桿菌溶液中所報告的顆粒濃度。雖然兩種儀器的絕 對濃度之間存在一些差異,但兩種儀器在樣本稀釋量和觀察到的顆粒濃度之間表現出很大的線性度,正如從線性回歸中獲得的高R2值所表明的。這些結果表明, FlowCam Nano能獲得一致的顆粒濃度,可以用來監測樣品中亞微米顆粒的相對數量,以及它們的大小和形狀。 

圖6:對大腸桿菌樣本不同稀釋的顆粒濃度。每個圓圈和三角形都代表一個單一的FlowCam Nano的測量。線條代表了相應儀器的濃度數據的線性匹配。每個趨勢線的R2值顯示在每條線上。

結論

FlowCam Nano是一種極具價值的亞微米顆粒分析工具,捕捉顆粒，分析大小和類型信息,擴展了傳統的FIM的典型測量范圍。此外, FlowCam Nano提供了與樣品顆粒含量一致的顆粒濃度。這些信息在分析蔗糖、細菌細胞和某些藥物輸送車輛等顆粒物的性能方面是無價的,通常在傳統的FIM的大小范圍內。在這些較小的物體上的信息也可能是有價值的,即使是在被發現的顆粒類型中,通常遇到的顆粒類型,如蛋白質聚集,在一定程度上是由較小的顆粒聚集而形成的。分析這些小的亞微米蛋白聚集物可以幫助用戶識別這些物體,然后才能聚集和形成更大的顆粒。 

采用FlowCam Nano的亞微米顆粒特性補充了其他分析技術。FlowCam Nano為用戶提供了從其他儀器中無法獲得的顆粒形態信息,這些信息可以用來確定樣本中的亞微米顆粒的類型。細菌細胞和更常見的生物反應顆粒和污染物。FlowCam Nano也可以用來擴展從FlowCam 8100和其他典型的FIM儀器提供的顆粒計數和大小分布,這能夠獲得比任何一種單一儀器更大的檢測范圍。這種結合的信息可以幫助用戶更好地了解他們的生物制藥樣本中的顆粒含量,從而對產品質量做出更快、更準確的決定。 

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