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從天然產(chǎn)物中尋找活性成分，全世界很多科研工作者一直在開展這項工作，特別是新冠疫情以來，科學家們也期待從天然產(chǎn)物中篩選出療效確切的抗病毒成分。本應用案例采用一個全新的方法組合：通過水提取，結合噴霧干燥&制備色譜聯(lián)用技術來探索簡單、快速、經(jīng)濟地獲取高純度天然活性成分紅榿木素（純度>95%）以及商業(yè)化的可行性，整個過程也極大減少了有機溶劑的使用，該方案也可以用于其它天然產(chǎn)物加工工藝中。我們在此分享，希望能給廣大科研同仁提供一些思路參考。

紅榿木是廣泛分布在北美太平洋西北部的硬木樹種，呈金黃色，也叫黃金榿木，喜溫暖氣候，出材率高，材質(zhì)堅硬有彈性和韌性。一般取芯材做木材后，丟棄了很大部分的樹皮、樹枝、葉子和較小莖等，這些殘留物被留在森林中、用作燃料、堆肥等。但其實里面含有藥用價值很高的天然產(chǎn)物化學物質(zhì)，具有治療發(fā)燒、出血、燒傷、抗氧化、抗菌和抗癌的特性。發(fā)揮該藥用價值的主要活性成分是二芳基庚烷類化合物，其中的紅榿木素{Oregonin，(5S)-1,7-bis(3,4-dihydroxyphenyl)-5-(β-D-xylopyranosyloxy)-heptan-3-one}含量最高，在葉子和樹皮中濃度高達4-9%。因此尋找工業(yè)化的提取、干燥和純化工藝處理大規(guī)模的林業(yè)加工殘留物，從而實現(xiàn)紅榿木更多的商業(yè)化價值。

紅榿木素和其它二芳基庚烷類化合物傳統(tǒng)的提取方法是采用氯仿、二氯甲烷、甲醇等有機溶劑進行索氏提取，該方法會溶解一部分植物中脂和蠟，后續(xù)需要進行脫脂處理，操作比較麻煩；同時有機溶劑的提取也不容易擴展到工業(yè)化生產(chǎn)。故直接采用水提法得到目標化合物，既經(jīng)濟又環(huán)保更安全；同時紅榿木素在103 ℃時易于降解，水萃取液如何除水就是一項挑戰(zhàn)了。對于熱敏性水提物的干燥方式常用冷凍干燥進行。但凍干需要的設備投入更大、耗時長、生產(chǎn)成本極高。故采用經(jīng)典的噴霧干燥法開辟一條新的可實現(xiàn)的工業(yè)化工藝。

01 儀器

02 水提取

將紅榿木葉、嫩枝和樹皮（50克）用水浸泡（150毫升），考察不同提取溫度（20/35/50/65 ℃），高速攪拌機攪拌10分鐘。所得漿液在實驗室環(huán)境溫度（22 ℃）下繼續(xù)攪拌 30 分鐘，隨后過濾以去除不溶性植物殘留物。過濾后的提取物在室溫下以 1400 rpm 的轉(zhuǎn)速離心 12 分鐘。所得上清液為半透明、橙褐色液體，待后續(xù)使用高效液相色譜法測試活性成分和噴霧干燥使用。

03 水提物的噴霧干燥

將不同溫度下獲得的提取液經(jīng)噴霧干燥得到粗紅榿木素提取物粉末。噴霧干燥工藝使用瑞士步琦公司小型噴霧干燥儀B-290進行，二流體噴嘴（噴嘴0.7mm和1.5mm噴嘴帽），搭配高效旋風分離器。實驗中以最大程度減少粉末損失，低出風溫度，收集瓶中物料含量來進行參數(shù)考察。噴霧干燥物料溶液固含物濃度約為1g/100ml。

優(yōu)化的工藝參數(shù)為：

進風溫度190℃，

出風溫度90℃，

干燥氣流量Aspirator 80%，

進料速度20mL/min。

紅榿木素的產(chǎn)率計算：

噴霧干燥所得粉末重量占進料水提液中總溶解固體重量的百分比。

紅榿木素的降解率計算：

噴霧干燥粉末中活性物含量與進料中溶解固體的紅榿木素含量的比率。

考慮到噴霧干燥是一種熱處理方式，工藝工程中可能導致物質(zhì)降解，有必要了解工藝過程中對活性物質(zhì)的影響。

04 誰提物噴霧干燥粉的分離純化

將噴霧干燥提取物干粉重新用蒸餾水溶解，配制成濃度為10%（w/w）的溶液，使用制備液相色譜（Flash）系統(tǒng)進行純化來獲得目標活性成分，采用液體上樣模式，批次進樣15mL。

純化條件：

洗脫溶劑：A:乙腈  B:水

初始平衡條件：水/乙腈(85:15% v/v)

色譜柱：商品化C18 Flash柱，(填料重量120g, 填料顆粒粒徑 20–25 μm)

流速：40 ml/mim

檢測波長：280 nm

梯度洗脫：合計 30 min

純化過程中收集的洗脫液餾分通過高效液相色譜（HPLC）方法分析，根據(jù)色譜峰面積法初步評估目標成分含量，餾分中紅榿木素含量大于85%的進行合并，并通過噴霧干燥進行干燥，用于獲得干燥產(chǎn)物。為了進一步評估峰面積法判斷準確性，每次進樣后測定的含最高濃度紅榿木素餾分進行合并，再干燥，對比標準品， 通過HPLC方法進行含量測定。在我們的研究中，要獲得純度大于90%的紅榿木素，可以輕松實現(xiàn)，回收率高達90%；當純度要求大于95%時，回收率將降低至45%以下。

05 HPLC分析

采用 HPLC 方法進行水提物和水提物噴霧干燥粉，以及Flash制備色譜純化后收集的餾分的檢測分析。色譜柱 C18 column (4.6 mm × 150 mm, particle size: 2.6 μm, pore size: 100 ?)，進樣量1μL, 流速1.0 mL/min。

下表為HPLC分析梯度洗脫條件：

06 結果分析與討論

提取工藝，噴霧干燥產(chǎn)率和活性物質(zhì)降解率：

上面表格中詳細記錄了不同提取溫度下提取液的噴霧干燥產(chǎn)率，熱降解率等。

從上表可以觀察到，在 20-50℃ 的提取溫度下，通過噴霧干燥除去溶劑后得到的紅榿木素降解率不到 10%。但在65℃時，降解率翻了一番以上，達到 21%。提取溫度為35℃時，噴霧干燥產(chǎn)率最高，為 75%。上述這一參數(shù)最終被采用，并進行后續(xù)的純化工藝。水提物中的紅榿木素濃度與提取溫度呈顯著的正相關（R=0.95，P=0.046）；然而，上述因素和工藝產(chǎn)率（R= -0.095，P=0.9）以及實際噴霧干燥粉末中的紅榿木素濃度（R=0.4，P=0.6），無顯著關聯(lián)。雖然噴霧干燥的進風溫度高達190℃，但是因為水分的蒸發(fā)是一個快速的吸熱過程，隨著蒸發(fā)的進行系統(tǒng)溫度不斷降低，物料在干燥過程中沒有接觸太高的溫度。而且噴霧干燥過程中，物料在干燥筒中停留時間短，所以可實現(xiàn)較低的紅榿木素降解率。當然設置更低的加熱溫度，也可以進一步降低熱降解率，但進料速度也會隨之降低。雖然本次實驗物料濃度低，固含物少，但噴霧干燥實驗過程平均產(chǎn)率仍能達到 70%，也達到實驗室噴霧干燥儀常見的回收率要求。另外，噴霧干燥提取物粉末顆粒是一種水溶性的棕色無定型態(tài)固體，有輕微的粘性和吸濕性。未來可以通過改進工藝，例如通過添加包封劑、抗黏劑，潛在地改善粉體粘性和吸濕性等。

制備液相色譜/Flash系統(tǒng)純化方法可靠性評估：

進行5次重復進樣，通過制備色譜純化，使用HPLC方法檢測各餾分中紅榿木素的含量。上表列出了單次純化工藝中，含最高紅榿木素濃度餾分的分析結果，包括紅榿木素回收率百分數(shù)和純度（按單個餾分中紅榿木素峰面積除以所有峰面積計算），相對標準偏差。紅榿木素主要分布在Flash純化后的兩組餾分中，兩組純度分別為 85.35% (3.11% RSD) 和 95.83% (1.00% RSD)。合并兩個餾分后，平均回收率為 90.25% (2.33% RSD)。上述結果RSD%都小于5%,表明采用的純化方法對測定回收率和純度都具有出色的可重現(xiàn)性。為了驗證根據(jù)峰面積判定純度的準確性，紅榿木素純度>95%的餾分液被干燥，通過HPLC方法，參照標準品進行紅榿木素的含量測定。

使用 80g 和 120g 的商品 Flash 柱，考察不同進樣量和流速對活性物質(zhì)分離的影響。80g Flash 色譜柱子的上樣量和流速為 10mL、40mL/min；120g 柱子的上樣量和流速為 15mL、60mL/min。上圖顯示了 280nm 檢測波長下，紅榿木素 Oregonin 在制備液相/Flash系統(tǒng)的分離情況，可以看出兩種色譜柱，兩種進樣量，紅榿木素都有著相似而且較好的分離結果，出峰時間 10-15min。紅榿木素在 120g 色譜柱的洗脫時間比 80g 色譜柱稍晚（分別為餾分 8-10 與餾分 6-8），但這細微的差異可能是由于色譜柱填料的系統(tǒng)誤差造成的，并不影響方法穩(wěn)定性以及工藝放大可能性。

07 結論

通過本研究，可以使用簡單經(jīng)濟的水提取工藝，最大限度地減少有機溶劑的使用；噴霧干燥高效快速地去除提取溶劑，使紅榿木素產(chǎn)率達 70% 以上，降解率也控制在 10% 以內(nèi)；制備色譜純化方法驗證中，各項指標的 RSD 均在規(guī)定的 5% 以內(nèi)，同時也可純化得到純度達 95% 以上的二芳基庚烷類紅榿木素。可見通過改良傳統(tǒng)萃取方法，采用噴霧干燥和制備色譜聯(lián)用技術，有利于實現(xiàn)天然產(chǎn)物從小試擴大到生產(chǎn)工藝中。

瑞士步琦公司能為您提供天然藥物分離純化、萃取、濃縮、干燥、制劑&造粒、檢測及質(zhì)量監(jiān)控等最優(yōu)解決方案。我們的解決方案能夠與工作流程進行完美的整合，從而最大程度地節(jié)省時間，提高工作效率。

應用文獻來源：Efficient purification of the diarylheptanoid oregonin from red alder (Alnus rubra) leaves and bark combining aqueous extraction, spray drying and flash-chromatography