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噴霧干燥 & 冷凍干燥技術(shù)

制備白細(xì)胞介素粉體研究

趨化因子是一種小的(8-12 kDa)細(xì)胞因子，參與許多病理過(guò)程，因此是重要的靶點(diǎn)。它們通常由不同類(lèi)型的細(xì)胞(如白細(xì)胞)分泌，并通過(guò)與同源 G 蛋白偶聯(lián)受體的細(xì)胞表面結(jié)合來(lái)介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。趨化因子配體和受體有 50 多種，根據(jù)其初級(jí)氨基酸序列的半胱氨酸殘基排列進(jìn)行分類(lèi)和命名。

趨化因子可用于(慢性)炎癥性疾病、癌癥和感染性疾病的治療應(yīng)用。目前，市場(chǎng)上有兩種基于白介素的產(chǎn)品，即重組白介素-11預(yù)白介素(Neumega?)和重組人白細(xì)胞介素-2醛白介素(Proleukin?)。Neumega? 是一種由大腸桿菌重組 DNA 技術(shù)產(chǎn)生的血小板生成生長(zhǎng)因子，可靜脈給藥。皮下應(yīng)用的 Proleukin? 是一種淋巴因子，也是通過(guò)轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的重組 DNA 技術(shù)產(chǎn)生的。為了增加儲(chǔ)存的穩(wěn)定性、保持藥物的生物活性，Neumega? 和 Proleukin? 都采用冷凍干燥的工藝，制成凍干粉制劑使用。

雖然冷凍干燥（FD）是一種廣泛使用的技術(shù)，具有多種優(yōu)點(diǎn)，可以快速、溫和干燥，但噴霧干燥(SD)可以縮短工藝周期，并可以在常壓下進(jìn)行加熱處理。同時(shí)，顆粒的性質(zhì)，如粒徑、固體狀態(tài)和殘余水含量可以通過(guò)參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。這里必須指出的是，蛋白質(zhì)的變性或/和展開(kāi)也可能發(fā)生在 SD 過(guò)程中，SD 過(guò)程的放大是復(fù)雜和高成本的。SD 的另一個(gè)重要挑戰(zhàn)是粉體回收率低于 100%，這對(duì)于高成本療法和工藝開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)是一個(gè)問(wèn)題，特別是放大到最終設(shè)備上。

對(duì)于白細(xì)胞介素，已經(jīng)有了一些成功的冷凍干燥研究案例。然而，據(jù)我們所知，SD 作為一種替代方法尚未被研究過(guò)。這項(xiàng)工作的目的是開(kāi)發(fā)一種 SD 工藝，使模型白介素以一種保留白介素結(jié)合親和力和生物活性的方式干燥。為此，我們使用了模型白細(xì)胞介素，探索噴霧干燥工藝的潛在可行性，并對(duì)比分析冷凍干燥和噴霧干燥工藝對(duì)白細(xì)胞介素活性影響。

1 材料

• 在磷酸鹽緩沖鹽水中提供野生型CXCL8（CXCL8，72個(gè)氨基酸，8.4kDa）、CXCL8的突變體（dnCXCL8，66個(gè)氨基酸，7.7kDa）等各種試劑。

• 將蛋白質(zhì)溶液用PBS稀釋至最終蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml，即1% w/w。

• 冷凍干燥機(jī)

• 噴霧干燥儀：BUCHI B-90 HP

▲ BUCHI B-90 HP

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

配方溶液分別采用如下凍干程序（表1）和噴干程序（表2）進(jìn)行樣品制備。干燥后的樣品在 4-8℃ 的氬氣干燥器中保存 12 周。并進(jìn)行粉體的物性表征。

表1，適用于所有配方中 FD 程序。箭頭表示間隔內(nèi)的壓力或溫度增減。

表2，SD 工藝參數(shù)及由此產(chǎn)生的過(guò)程變量。通過(guò)使用純緩沖液進(jìn)行測(cè)量來(lái)確定以 ml/min 為單位的噴射速率。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中噴嘴溫度升高，噴嘴溫度是在 SD 過(guò)程結(jié)束時(shí)觀察到的溫度 。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、 通過(guò)激光衍射分析測(cè)定粒徑

SD 蛋白粉通過(guò) HELOS 系統(tǒng)的激光衍射分析進(jìn)行篩選。在 SD 后和第4周、第8周和第12周將粉末直接濕分散在甲苯中進(jìn)行分析。通過(guò)對(duì)同一批次 SD 粉的三個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)量，確定了 PSD 分析的標(biāo)準(zhǔn)誤差。不分析 FD 粉末的粒度，因?yàn)閮龈晌锿ǔＪ亲罱K的藥物劑型，沒(méi)有對(duì)餅狀進(jìn)行研磨或破碎，只分析了 SD 粉。

圖1 通過(guò)激光衍射分析測(cè)定粉體粒徑，在 10 次超聲脈沖后進(jìn)行測(cè)量，SD 粉末的 PSD 隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化不大。除了在第0周分析的 SD dnCXCL8 噴霧粉末和在第8周分析的 SD HSA-dnCXCL8 外，所有干粉的跨度都小于 2.8。在測(cè)量這兩個(gè) PSD 時(shí)，一些較大的團(tuán)塊將分布分別向 517μm 和 129μm 的 x90 方向移動(dòng)(圖1b、圖1c)，導(dǎo)致 PSD 變寬。

2、 圓二色光譜測(cè)定結(jié)構(gòu)

利用圓二色譜(CD)對(duì) SD 和 FD 后的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，并將其與未處理蛋白質(zhì)的光譜進(jìn)行比較。CD 光譜在設(shè)備上記錄，波長(zhǎng)為 190-250nm，使用 1mm 石英比色皿，響應(yīng)時(shí)間 4s。5 次掃描取平均值，并用 PBS 校正背景，計(jì)算平均殘基橢圓率，并繪制不同曲線(xiàn)。

由 圖4 顯示，經(jīng)過(guò) SD 和 FD 后的 CD 光譜顯示只有輕微的結(jié)構(gòu)變化。液體白細(xì)胞介素制劑在 90℃ 溫度下熱處理5分鐘，SD 溫度在 60℃ 溫度下熱處理 5 分鐘，會(huì)產(chǎn)生輕微的沉淀，但結(jié)構(gòu)保持完整 (圖4A)。dnCXCL8 也出現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。SD 和 FD 均未引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。即使加熱蛋白質(zhì)也未引起二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化(圖4B)。雖然 HSA-dnCXCL8 具有更明確的α-螺旋結(jié)構(gòu)，但 SD 和 FD 后沒(méi)有變化。在 90℃ 熱處理 5min 后二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了完全損失 (圖4C)。

3、 離液展開(kāi)測(cè)定穩(wěn)定性

采用熒光光譜檢測(cè)gdmhcl在0-6M范圍內(nèi)誘導(dǎo)展開(kāi)，并在SD和FD后和儲(chǔ)存3個(gè)月后測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。將樣品稀釋至0.7μM，并在室溫下平衡5min。CXCL8 和dnCXCL8 的激發(fā)波長(zhǎng)為 280nm, HSA-dnCXCL8 的激發(fā)波長(zhǎng)為 290nm。在 300-400nm 范圍內(nèi)測(cè)量所有3種蛋白的發(fā)射光譜，并將狹縫寬度設(shè)置為 5nm。蛋白質(zhì)展開(kāi)的特征是波長(zhǎng)移位，并使用 Origin 2019b 的玻爾茲曼進(jìn)行計(jì)算得到如下圖譜。

圖5 顯示，展開(kāi)的過(guò)渡中點(diǎn)和 CXCL8 的相對(duì)協(xié)同性在很大程度上沒(méi)有變化。對(duì)于 dnCXCL8，無(wú)法建立明確的過(guò)渡點(diǎn)。對(duì)于 FD HSA-dnCXCL8 也觀察到了同樣的情況。對(duì)于參考光譜和 FD 光譜（HSA-dnCXCL8 除外），顯示了標(biāo)準(zhǔn)偏差，如圖中的誤差條所示。

4、 趨化性測(cè)試：博伊登室測(cè)定

為了檢測(cè) SD 和 FD 后以及儲(chǔ)存三個(gè)月后的白細(xì)胞介素的活性，進(jìn)行了趨化試驗(yàn)測(cè)定中性粒細(xì)胞的活化和遷移，預(yù)計(jì) CXCL8 具有促遷移作用，而 dnCXCL8 和HSA-dnCXCL8 不應(yīng)表現(xiàn)出任何中性粒細(xì)胞遷移激活。使用 NIS-Elements BR 3.2 軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每種情況下的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

上圖顯示儲(chǔ)存 12 周后 SD CXCL8 的 CI 較對(duì)照顯著增加 (圖6a, p = 0.05)。SD 和 FD CXCL8 在中性粒細(xì)胞活化和遷移方面沒(méi)有變化。對(duì)于 dnCXCL8, SD 和 FD 樣本的 CI 與各自的參考 CI 相當(dāng)。HSA-dnCXCL8 在 SD 后 (即W0) 的 CI 顯著增加 (圖6c, p = 0.04)。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)磷酸鹽緩沖鹽水配制的白細(xì)胞介素（未添加額外添加劑）采用 SD 和 FD 兩種干燥方式分別進(jìn)行深入評(píng)估。用純緩沖液進(jìn)行的 DoE 確定了一種最佳的 SD 工藝，在 60℃ 的干燥空氣溫度、100 L/min 的空氣流速和 30% 的噴霧速率下具有較高產(chǎn)率，這表明即使是熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)也可以噴霧干燥。此外，SD 工藝比 FD 更快、更有效，理論上導(dǎo)致每分鐘產(chǎn)量比 FD 高 130 倍（甚至考慮到 SD 的產(chǎn)量?jī)H 63% 和 77% 之間）。FD 粉末呈現(xiàn)餅狀結(jié)構(gòu)，而 SD 粉末的粒度為 X50<20μm。這為粒子工程提供了定義粒子特性的可能性，允許更廣泛的應(yīng)用。RM 是可比較的，同樣二級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變，結(jié)合親和力和活性保持至少 12 周，這些結(jié)果表明白細(xì)胞介素的 SD 是可行的。未來(lái)，將繼續(xù)優(yōu)化本研究中的工藝參數(shù)，并將其轉(zhuǎn)移到具有工業(yè)型臺(tái)式噴霧干燥器中，以更大規(guī)模地系統(tǒng)考察粉體產(chǎn)量和工藝時(shí)間，從而對(duì) SD 進(jìn)行全面評(píng)估，作為 FD 的替代方案，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)快捷高效的生產(chǎn)！

5 文獻(xiàn)來(lái)源

Comparing freeze drying and spray drying of interleukins using model protein CXCL8 and its variants