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聲學(xué)微滴噴射（AED）技術(shù)使用聚焦的聲能實(shí)現(xiàn)高精度和準(zhǔn)確度轉(zhuǎn)移納升級(jí)液滴。Echo這種非接觸式、無(wú)需吸頭、低體積加液技術(shù)將交叉污染的可能性降至最低，同時(shí)極大程度降低試劑和耗材的成本。迄今為止，Echo除了廣泛應(yīng)用于高通量化合物篩選之外，還有另一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)應(yīng)用方向——快速發(fā)展的合成生物學(xué)領(lǐng)域，如DNA合成和連接，Echo聲波移液使得PCR以及Golden Gate 和 Gibson兩種一步法DNA連接方法成功地縮小至納升級(jí)規(guī)模，極大地提高DNA合成和連接效率并有效將試劑成本降低20至100倍。大部分DNA組裝的費(fèi)用成本是酶，包括DNA聚合酶，因此，將反應(yīng)體積從微升縮小到納升級(jí)，同時(shí)保持高裝配效率，將使合成生物學(xué)家更容易完成DNA合成和組裝。這也使Echo聲波移液成為DNA生物鑄造廠時(shí)代的合成生物學(xué)中的一項(xiàng)工具性技術(shù)。比如在常規(guī)終點(diǎn)法PCR實(shí)驗(yàn)中，Echo可將PCR反應(yīng)體系降低至250nL，成功擴(kuò)增出1.3kb的片段。

圖1 通過(guò) Echo進(jìn)行PCR體系構(gòu)建。

Gibson DNA連接方法是合成生物學(xué)中使用最多的技術(shù)，它可以組裝從DNA序列至小基因組重疊DNA片段大小，優(yōu)點(diǎn)是它與序列無(wú)關(guān)并生成無(wú)痕DNA連接產(chǎn)物。Golden Gate DNA連接方法利用TypeIIS限制性內(nèi)切酶和連接酶組合來(lái)組裝DNA片段。正如我們先前所介紹的一樣，使用Echo聲波移液，能夠?qū)崿F(xiàn)這兩種一步式DNA連接反應(yīng)的降本增效，可在250 nL、500nL和1000 nL反應(yīng)體積下實(shí)現(xiàn)Gibson的正確組裝，效率可與手工實(shí)驗(yàn)相媲美或優(yōu)于20 μL反應(yīng)，這使試劑成本降低20倍以上；Golden Gate可實(shí)現(xiàn)50 nL 、250 nL和500 nL規(guī)模反應(yīng)體積的DNA（手工實(shí)驗(yàn)時(shí)通常為 15 μL反應(yīng)）成功組裝，效率同樣高于手工實(shí)驗(yàn)對(duì)照，使試劑用量至少降低30倍。

生物合成途徑的闡明和重構(gòu)以及調(diào)控回路和網(wǎng)絡(luò)的工程設(shè)計(jì)，都需要蛋白質(zhì)功能的知識(shí)。植物一直被用作生物活性和高價(jià)值天然產(chǎn)物的來(lái)源，但由于植物之中大型基因家族的普遍存在，使得將特定功能與單個(gè)蛋白質(zhì)聯(lián)系起來(lái)具有挑戰(zhàn)性，同時(shí)也面臨需要付出大量努力來(lái)優(yōu)化表達(dá)和純化方案進(jìn)行蛋白質(zhì)表征這一技術(shù)瓶頸。Biofoundry的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)能夠加速“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”周期的能力，可加速優(yōu)化并實(shí)現(xiàn)酶活性的快速篩選；無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）結(jié)合了DNA模板、能量源、氨基酸、核苷酸三磷酸 （NTP） 和過(guò)量輔因子，以及含有翻譯機(jī)制的粗裂解物，是一種成熟的體外快速蛋白質(zhì)生產(chǎn)工具，顯著優(yōu)勢(shì)是能夠直接進(jìn)行功能分析，而無(wú)需耗時(shí)的細(xì)胞破碎和純化方案，同時(shí)還適用于自動(dòng)化和小型化，減少操作錯(cuò)誤和CFPS反應(yīng)中的可變性，促進(jìn)主動(dòng)學(xué)習(xí)引導(dǎo)的反應(yīng)條件優(yōu)化，并普遍增加實(shí)驗(yàn)的通量，最大限度地減少DBTL循環(huán)中的“構(gòu)建”時(shí)間。SynTrack是一個(gè)基于web的工作流程驅(qū)動(dòng)的bioCAM平臺(tái)，用于管理和跟蹤DNA制造過(guò)程。SynTrack導(dǎo)入boost指定的構(gòu)建過(guò)程信息，其中包括操作人員（利用機(jī)器人平臺(tái)）執(zhí)行所有“構(gòu)建”操作的分步說(shuō)明。SynTrack可以為液體處理機(jī)器人（如Biomek FX和Echo平臺(tái)）生成移液指令，自動(dòng)將接收到的DNA片段重新排列到孔板中。通過(guò)Echo自動(dòng)化平臺(tái)構(gòu)建2μL反應(yīng)體積（手動(dòng)為20μL）進(jìn)行一步法Golden Gate DNA組裝反應(yīng)，隨后構(gòu)建2μL CFPS反應(yīng)體系進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過(guò)熒光素酶（該標(biāo)簽可輕松去除）快速定量蛋白表達(dá)水平，隨后無(wú)需蛋白純化即可使用游離蛋白質(zhì)合成反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行多種功能表征。

圖2 Biofoundry輔助DNA組裝和植物蛋白游離蛋白合成（CFPS）的工作流程。編碼目的蛋白的0級(jí)DNA部分（模塊）可以組裝成用于CFPS或在植物中表達(dá)的功能表達(dá)質(zhì)粒。使用Echo篩選蛋白質(zhì)變體的文庫(kù)，使用 HiBiTLgBiT熒光素酶發(fā)光實(shí)驗(yàn)定量確定最佳表達(dá)構(gòu)型。

使用Echo聲波移液配合無(wú)細(xì)胞蛋白合成（CFPS）技術(shù)也可在96和384孔板中進(jìn)行代謝工程檢測(cè)，通過(guò)Wood-Ljungdahl通路耦合的反向β氧化（r-BOX）通路，實(shí)現(xiàn)如C4-C6酸和醇生化產(chǎn)物的負(fù)碳合成，具有降低全球CO2排放的巨大應(yīng)用潛能。正是由于模式生物大腸桿菌無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄-翻譯（TXTL）在DNA定向體外蛋白質(zhì)合成的應(yīng)用范圍越來(lái)越大，一些實(shí)驗(yàn)室也開(kāi)發(fā)了全大腸桿菌TXTL工具箱，并通過(guò)Echo實(shí)現(xiàn)了流程自動(dòng)化。另一個(gè)無(wú)細(xì)胞合成生物應(yīng)用方向是非模式生物體外原型設(shè)計(jì)和快速表征代謝途徑，加速體內(nèi)生物合成途徑測(cè)試，使例如梭狀芽胞桿菌等非模式生物能夠利用可再生資源（木質(zhì)纖維素生物質(zhì)或CO和H2合成氣）生產(chǎn)更多高價(jià)值產(chǎn)品。使用DNA組裝設(shè)計(jì)自動(dòng)化軟件J5進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和生成實(shí)驗(yàn)運(yùn)行worklist，發(fā)送至Echo自動(dòng)化平臺(tái)以2 μL體積進(jìn)行Golden Gate DNA組裝，可同時(shí)進(jìn)行多達(dá)6個(gè)部分（三個(gè)獨(dú)特啟動(dòng)子和終止子序列的開(kāi)放閱讀框）的組裝，效率高達(dá)90%；這一質(zhì)粒系統(tǒng)將為非模式生物提供體外和體內(nèi)生物合成途徑的簡(jiǎn)單測(cè)試框架，從而縮短開(kāi)發(fā)周期。非模式生物巨雙歧桿菌的天然無(wú)細(xì)胞（NCF）轉(zhuǎn)錄翻譯平臺(tái)的快速建立也借助了Echo，并和貝葉斯模型參數(shù)推斷方法相結(jié)合，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)基因表達(dá)工具進(jìn)行嚴(yán)格的表征，并且這個(gè)平臺(tái)還有望擴(kuò)展到一系列其他重要的底盤(pán)微生物的合成生物學(xué)應(yīng)用。

圖3 使用兼容的無(wú)細(xì)胞載體系統(tǒng)組裝三基因構(gòu)建體的Golden Gate。（a）Golden Gate組裝工作流程的示意圖，包括自動(dòng)化組裝，包括質(zhì)粒的計(jì)算設(shè)計(jì)、Echo自動(dòng)化液體處理操作指令、質(zhì)粒組裝和質(zhì)粒確認(rèn)。（b）含有構(gòu)建的梭狀芽孢桿菌表達(dá)載體的六個(gè)克隆中的質(zhì)粒組裝的PCR鑒定。

圖4 非模型微生物的無(wú)細(xì)胞原型設(shè)計(jì)。（A）在NCF中使用內(nèi)源性能量再生和轉(zhuǎn)錄-翻譯組分測(cè)試合成的基因表達(dá)質(zhì)粒。（B）在B. megaterium NCF中使用MGapt（mRNA）適配體和GFP進(jìn)行平行轉(zhuǎn)錄-翻譯測(cè)定。（C）借助Echo液體處理工作站，用于快速篩選無(wú)細(xì)胞反應(yīng)的半自動(dòng)化工作流程。

微生物系統(tǒng)中異源生產(chǎn)的特定高價(jià)值化學(xué)物質(zhì)大多需要資源密集型分析過(guò)程（如HPLC和MS）進(jìn)行定量，較低的分析通量使DBTL循環(huán)遇到了一定的瓶頸。而生物傳感器通常與基因表達(dá)系統(tǒng)耦合，為此人們?cè)絹?lái)越關(guān)注開(kāi)發(fā)熒光生物傳感器用于合成生物學(xué)中，來(lái)檢測(cè)小分子和物理信號(hào)。通過(guò)為Echo編寫(xiě)Python移液腳本，構(gòu)建384或1536孔板的10μL或2μL熒光酶標(biāo)檢測(cè)體系，基于大腸桿菌雙鍵還原酶（EcCurA）非特異性結(jié)合后熒光極大增強(qiáng)的特性，開(kāi)發(fā)了一種熒光復(fù)合物直接蛋白質(zhì)（DiPro）生物傳感器，作為微生物異源姜黃素酶促合成的檢測(cè)單元，且不需要任何額外的基因表達(dá)后步驟或特定的蛋白質(zhì)成熟要求。同樣，使用Echo進(jìn)行小反應(yīng)體系的熒光素酶化學(xué)發(fā)光體系構(gòu)建，高通量篩選分析脯氨酰寡肽酶異源表達(dá)變異株，將金屬響應(yīng)開(kāi)關(guān)整合到蛋白質(zhì)中，也為精確調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能提供了新的機(jī)會(huì)。

圖5 Ni(II)依賴的開(kāi)關(guān)

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，使得通過(guò)大腸桿菌或釀酒酵母等微生物用于篩選氫化烯烴的酶，成為克服石油精煉過(guò)程中烯烴加氫面臨的催化劑中毒、傳質(zhì)限制、發(fā)熱以及與氫氣、儲(chǔ)存和催化劑等相關(guān)的一個(gè)重要的解決方案。相比于LC/GC-MS復(fù)雜的工作流程和較長(zhǎng)的分析時(shí)間，使用Echo聲波移液和薄層色譜搭建的自動(dòng)化96孔篩選平臺(tái)極大地提高了檢測(cè)速度，使并行多個(gè)樣品檢測(cè)即時(shí)可視化，讀值結(jié)果更可靠，成為一種高效的篩選流程，用于確定與工程化GGR蛋白文庫(kù)相關(guān)的酶活性和產(chǎn)物形成譜。使用Echo將環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)物“打印”涂覆在薄層二氧化硅上，根據(jù)環(huán)氧化程度進(jìn)行色譜分離，并與發(fā)色團(tuán)共價(jià)連接，從而可以檢測(cè)具有獨(dú)特產(chǎn)物分布或增強(qiáng)還原酶活性的酶變體。經(jīng)過(guò)GC-MS驗(yàn)證，這種基于薄層色譜的篩選可以區(qū)分選定突變體酶活性的四倍差異。

圖6 靶向SaGGR（源自嗜酸熱硫化葉菌的香葉基香葉基還原酶）中L377X（377位亮氨酸）的密碼子飽和誘變文庫(kù)高通量篩選方案

圖7 Echo聲波噴射液滴的優(yōu)化和時(shí)程分析中的應(yīng)用。a，通過(guò)Echo轉(zhuǎn)移到二氧化硅-TLC板上的考馬斯染色劑。確定50 nL為同時(shí)進(jìn)行48孔TLC分析的最佳體積。b, 30 μM WT SaGGR與2 mM法尼醇一起孵育的時(shí)程測(cè)定，每分鐘用環(huán)氧化試劑淬滅，并在單獨(dú)的泳道中點(diǎn)樣。隨著測(cè)定演化到其 48 分鐘的終點(diǎn)，對(duì)應(yīng)于H環(huán)氧化物衍生物的條帶H0-, H2-和H4-FOH用Rf(1)、Rf(2)和 Rf(3)表示，并分別增加強(qiáng)度，而副產(chǎn)物帶 Rf(s2)和Rf(S3)隨時(shí)間保持相對(duì)恒定。c, 從b中描述的時(shí)間過(guò)程得出的氣相色譜圖描述了法呢醇（H0）、di-(H2)和四氫法尼醇(H4)

Echo高通量DNA組裝還被用于在釀酒酵母固氮基因組合文庫(kù)中篩選功能性固氮酶異源表達(dá)基因，為固氮谷物開(kāi)發(fā)并改變?nèi)蜣r(nóng)業(yè)系統(tǒng)提供極大支撐。DNA組裝和Echo自動(dòng)化液體處理結(jié)合技術(shù)也入選了高校合成基因組暑期課程，這一培訓(xùn)課程旨在向研究人員傳授合成生物學(xué)和合成基因組科學(xué)最新進(jìn)展背后的理論和實(shí)踐技能，通過(guò)軟件研討會(huì)、課程和該領(lǐng)域領(lǐng)先成員的研究講座，與會(huì)者能夠在了解相關(guān)原理和技術(shù)的同時(shí)，在基于實(shí)驗(yàn)室的實(shí)踐課程中直接使用合成生物學(xué)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的軟件和載體進(jìn)行驗(yàn)證。在課程具體實(shí)踐中，Echo自動(dòng)化DNA組裝技術(shù)大大提高了用于設(shè)計(jì)β-胡蘿卜素異源通路文庫(kù)的表達(dá)檢測(cè)的通量。同時(shí)，使用該平臺(tái)進(jìn)行的番茄紅素代謝途徑的自動(dòng)化設(shè)計(jì)和構(gòu)建成果也于2020年發(fā)表。

圖8 帝國(guó)理工學(xué)院暑期合成基因組培訓(xùn)課程。（a）實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，（b）自動(dòng)DNA組裝編程，（c）合成基因組軟件工具研討會(huì)和（d）SCRaMbLE教程。

通過(guò)以上案例我們可以發(fā)現(xiàn)，Echo聲波移液在DBTL循環(huán)中起到承上啟下的串聯(lián)角色，既可接受“設(shè)計(jì)”流程中基于集成運(yùn)算生成的腳本指令完成DNA組裝，撐起“構(gòu)建”階段一眾重要的應(yīng)用方向；又可在“測(cè)試”過(guò)程中實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化以及小體系精準(zhǔn)檢測(cè)，并傳遞數(shù)據(jù)為“學(xué)習(xí)”階段提供支撐，因而是合成生物學(xué)和Biofoundry不可或缺的好幫手。

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