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乳佐粒徑控制標準及解決方案

摘要：乳佐劑主要是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑組成的液體。國內外對乳佐劑已有廣泛研究，包括物料性質、穩定性、佐劑效果和安全性。乳佐劑的廣闊應用前景促使科研工作者深入研究其增強免疫的機制，以期為新產品開發，標準質控及臨床應用提供可靠的依據。目的：粒徑大小是乳佐的重要性質和評價指標之一。方法：文中涉及的乳佐劑制備采用了高壓微射流均質，采用動態光散射以及單顆粒光學傳感技術研究了乳佐粒徑分布狀態。結論：通過納米粒度儀以及全自動計數粒度分析儀可對乳佐的粒徑進行多方位分析檢測。

關鍵詞：乳佐劑 納米乳 微乳  粒徑分布 均質機 動態光散射（DLS） 單顆粒光學傳感技術（SPOS） 大乳粒

長期以來傳染性疾病一直都是人類健康的重大威脅之一，目前接種疫苗仍然是控制它的有效手段。在眾多行業黯然失色的年月里，疫苗行業這兩年反而激增，疫苗佐劑發揮了不可替代的作用。上世紀末，人們研制出水-油乳劑（Oil-water emulsion）類型的佐劑，并大規模用于疫苗開發和臨床試驗。

粒徑大小是微觀顆粒的最重要性質和評價指標之一。依據納米概念的定義，嚴格意義上將粒徑10~100nm的乳劑稱為納米乳，粒徑100~1000nm的稱為微乳。顆粒的細胞運輸方式具有顯著的粒徑依賴性，較小粒徑的顆粒在作為疫苗佐劑時更具有潛在的優勢。

乳佐劑一般需具有以下特征：

1. 均勻性好，運載并保護抗原，能有效包裹或吸附抗原。

2. 增加抗原表面積及大小，改變免疫應答的類型。

3. 緩釋抗原，乳佐劑能延長抗原或多肽的半衰期，使抗原與淋巴系統有充分的接觸時間，產生持久免疫應答。

4. 穩定性好：物理穩定性好且易過濾，經熱壓滅菌或離心不分層，易于制備和保存，適合大規模生產。

 有研究表明，佐劑顆粒的大小影響免疫反應的類型，200~600nm大小的顆粒容易通過淋巴結利用抗原遞呈細胞激發Th1型細胞免疫反應，而2~8μm的顆粒則是由巨噬細胞的吞噬或胞飲作用運輸至淋巴結，激發體液免疫。在研究SPO1微乳佐劑時發現150nm的顆粒佐劑效果較好，認為該種粒子既能有效吸附抗原又能激發吞噬細胞的識別，而100nm以下的顆粒不能捕獲抗原，而200nm以上的則不穩定或不引發理想的免疫應答。有研究提出將500nm作為一個分水嶺，因為500nm以上和小于500nm的粒子激發完全不同的免疫反應。乳佐劑雖然大小分布相對均勻，但其粒徑仍是一個范圍，以現階段的研究資料，通過單一儀器來進行一個完全精確區分佐劑效果的界值相對還很難，我們以MF59為例，展示國際廠家在乳佐粒徑控制上，通過DLS和SPOS技術進行的詳細控制要求。^[3]

1）初剪切制備初始乳液，初乳平均粒徑應控制在300nm~800nm，且大于1.2μm的油滴數量應控制在5*10⁹以下；

2）初乳經過微射流均質機處理以減少其液滴尺寸，微射流后的乳液平均粒徑應控制在165nm以下，大于1.2μm的油滴數量應控制在2*10⁸/ml以下；

3）微射流處理后的乳液經過適當的親水膜過濾。過濾可去除前置工藝流程中的大油滴，這部分油滴雖然數目很少，但這些油滴體積可能很大，它們或可成為聚集的成核位點，導致儲藏過程中乳液降解。另外，過濾步驟可實現過濾除菌。過濾后的水包油乳液平均粒徑一般在155nm±5nm，大于1.2μm的顆粒數量控制在5*10⁵ml/ml以下。

 為了獲得穩定的乳佐劑體系，乳粒的制備及表征至關重要。乳液組分可用Nicomp 380測定平均乳滴粒徑，可用Accusizer A7000 APS檢測大于1.2μm以上顆粒數。

結論：通過詳細控制要求我們可知 ，剪切后的初乳通過微射流均質機進行粒徑控制，在粒徑表征上，分別采用DLS進行粒徑分布（平均粒徑、PI值等）和SPOS技術進行尾端顆粒濃度控制（＞1.2μm的顆粒濃度）。

相關儀器如下：

微射流均質機

品牌：意大利PSI，PSI-20，PSI-40系列（實驗室及中試型）；Infinity系列（生產型）

原理：高壓微射流均質機通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作用下以極大的速度流經固定幾何結構均質腔中的微管通道，物料流在此過程中受到超高剪切力、高碰撞力、空穴效應等物理作用，使得平均粒徑降低、體系分散更加均一，由此獲得理想的均質或乳化結果。

制備關鍵點：均質腔類型、均質腔孔徑、均質壓力

 應用：對于不同領域的各類均質需求，大致可以歸納為“乳化型”以及“解團聚型”，針對乳佐劑可選擇“Y”型均質腔，物料流體在加速過程中被分為兩股細流，通過細微空槽后正面碰撞混合，在獲得較高的結合相對速度時其本身所受的碰撞力較柔和，此過程有利于混合、乳化作用。另外WO 2011/067669里也有介紹，Z型腔在尾端大顆粒的控制上，要比Y型腔有更好的效率。

                                                                             儀器外觀

納米粒度及Zeta電位分析儀

 品牌：美國PSS，Nicomp系列

 原理：納米粒度儀采用動態光散射原理（DLS）檢測分析樣品的粒度分布。基于多普勒電泳光散射原理檢測Zeta電位。其主要用于檢測納米級別及亞微米級別的體系，粒徑檢測范圍0.3nm-10μm，Zeta電位檢測范圍為±500mV。DLS從傳統的光散射理論中分離，關注光強隨著時間的波動行為。我們通過光強值的波動得到自相關函數，從而獲得衰減時間常量τ，跟進公式換算獲得粒子的擴散系數，再根據Stocks-Einstein方程計算粒徑大小。

 檢測關鍵點：粘度、折光率、溫度

 應用：用于分析乳佐劑整體粒徑分布情況（包括平均粒徑、PI值、D10、D90等），判斷配方及工藝制備后粒徑大小是否符合要求。

                                                                             原理圖

                        儀器外觀

全自動液體顆粒計數器

 品牌：美國PSS,Accusizer系列

 原理：單個粒子通過狹窄的光感區時阻擋了一部分入射光，引起到達檢測器的入射光強度瞬間降低，強度信號的衰減幅度理論上與粒子橫截面（假設橫截面積小于光感區的寬度），即粒子直徑的平方成比例。用標準粒子建立粒徑與強度信號大小的校正曲線。儀器測得樣品中顆粒通過光感區產生的信號，根據校正曲線計算出顆粒粒徑。傳統光阻法的范圍下限一般到1.5μm。PSS開創性地通過光散射增加對小粒子的靈敏度，將單顆粒傳感器的計數下限拓展至0.5μm。

 檢測關鍵點：濃度、流速。

 應用：定量分析0.5μm以上的顆粒粒徑分布以及濃度，彌補粒度分布儀器對尾端少量顆粒的不敏感性，從而判斷均質工藝是否有效將尾端大顆粒進行控制。針對乳液這類高濃度樣品，PSS粒度儀專為Accusizer A7000系列開發出的二部自動稀釋系統，該系統可將超高濃度樣品稀釋至目標濃度，減少人工稀釋的誤差和時間成本。將樣品自動稀釋后，保證粒子“單個”通過傳感器，開始采集數據。系統跟進稀釋因子自動還原樣品的原始顆粒濃度，解決了高濃度樣品的檢測難題。

                                                                                        儀器外觀

  乳佐劑作為載藥系統已引起廣泛關注并有所應用，乳佐劑的均勻穩定性及合適顆粒大小能保護并緩釋抗原，其增強免疫主要是基于納米顆粒的性質和激發機體免疫應答，并因顆粒大小的不同引發不同型的免疫反應。從研發小試到工藝生產，通過表征數據來直觀判斷配方及工藝的有效性，對比不同配方及工藝對最終粒徑大小、顆粒濃度，通過這些數據指標可適當調整配方以及微射流均質機壓力和均質次數，進而優化制備工藝。

不同均質壓力后體系尾端大顆粒濃度分布

紅色：800bar   藍色：1200bar

參考資料：

[1]趙蘭華, 李映波. 乳佐劑免疫機制的研究進展[J]. 醫學研究雜志, 2014, 43(2):4.

[2]Yu S,Tang C,S,Shi X,et al.Novel Th1 - biased adjuvant,SPO1,enhances mucosal and systemic immunogenicity of vaccines administered intranasally in mice(J).Vaccine,2012,30:5425 - 5436

[3]WO 2011/067669